论文部分内容阅读
摘 要：以槭树“秋天火焰”变色期秋季叶片为试材，采用改良CTAB法提取叶片总RNA，利用GenBank中相关物种的UFGT基因序列设计特异引物，进行RT-PCR扩增并对RT-PCR反应体系中的引物、退火温度和循环次数进行优化，建立了槭树叶片UFGT基因的RT-PCR扩增反应体系。
关键词：槭树；UFGT；RT-PCR
中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0001-04
彩叶树种的叶色表达是遗传因素和外部环境（光照、温度、水分和矿物质营养）共同作用的结果，二者通过改变树种叶片中各种色素的种类、含量以及分布形成了多彩的叶片。彩叶树种叶片呈现彩色的直接原因就是叶片中的色素种类和比例发生了变化。类黄酮糖基转移酶（UDP glucose-flavonoid-3-o-glycosyltranferase，UFGT） 是花青苷合成途径的最后一个酶，它使不稳定的花青素转变成稳定的花青苷[1]，并且该酶催化多种花青苷，甚至可以催化黄酮醇的糖苷化。Boss等以黑色果皮的Shiraz葡萄品种的几种不同组织为试材，检测花青苷生物合成的几个相关基因的表达情况，发现只有UFGT基因在果皮上特异表达，而其它的基因在各组织中均有表达；UFGT基因在有色葡萄中表达，而在白葡萄皮中不表达，说明UFGT基因是葡萄皮着色的关键基因[2，3]。
槭树是重要的秋季色叶树种，在世界各地园林景观中广泛应用。目前对其研究主要集中在栽培[4]、酶活性[5]、光合日变化[6，7]等方面，关于槭树叶色表达相关基因克隆方面的研究则较少。本研究以槭树秋季叶片为试材，对扩增UFGT基因的RT-PCR反应体系进行优化，从而建立起高效特异的槭树叶片UFGT基因扩增PCR体系。
1 材料与方法1.1 材料
试验于2011年11月在山东省果树研究所进行，以槭树品种“秋天火焰”（Acer×freemanii‘Autumn Blaze’）的秋季变色叶片为试材，采自山东省果树研究所彩叶树种种质资源圃。于11月份采集叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80℃冰箱中备用。1.2 试剂
CTAB、SDS、EDTA、NaCl、PVP、LiCl、DEPC、Tris碱、巯基乙醇、蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、琼脂糖、琼脂粉等为进口分析纯试剂；异戊醇、氯仿、无水乙醇等为国产分析纯试剂；PCR kit、cDNA kit；PCR引物合成由上海生工生物技术公司进行。玻璃器皿于180℃烘烤8 h，塑料制品等用0.1% DEPC水浸泡过夜后高压灭菌。
由于RNA在RNA酶的作用下非常容易降解，RNA 提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水处理并高压灭菌，含Tris的溶液用经高压灭菌的DEPC水直接配制。1.3 RT-PCR体系的建立
1.3.1 RNA提取及反转录 总RNA提取参考招雪晴等[8]的方法，采用改良CTAB法提取，将提取到的总RNA用cDNA反转录试剂盒进行反转录。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度计测量OD值。
1.3.2 UFGT基因的引物设计 根据GenBank中（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）登录的相关物种的UFGT基因的保守序列设计6对简并引物。
1.3.3 PCR 反应体系优化 （1）引物筛选：以反转录后的cDNA为模板，采用不同的引物进行PCR扩增，以筛选最佳引物。采用25 μl的反应体系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl，Taq酶 0.2 μl，灭菌蒸馏水 14.3 μl。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，56℃退火20 s， 72℃延伸20 s，35个循环；72℃保温10 min。
（2）最佳退火温度的确定：反应体系不变，采用筛选出的引物，设置不同的退火温度（50、51、56、58、60、63、65℃）进行梯度PCR，以确定最佳的退火温度。
（3）PCR反应体系的进一步优化：确定了最佳引物和最佳退火温度后，通过缩短变性时间、减少循环次数等措施进一步对得到的PCR反应体系进行优化。
2 结果与分析2.1 总RNA的制备
利用改良的CTAB法提取槭树叶片的RNA，如图1所示，测量其OD值，结果为2.01，表明蛋白污染少；用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，28S、18S、5S条带较清晰，没有降解现象。说明所提取的RNA纯度和完整性较好，无DNA污染，符合cDNA合成的要求。
2.3 PCR 反应体系优化
2.3.1 最佳筛选引物 对设计的6对引物进行常规PCR扩增，筛选最佳的引物序列。由图2看出，引物1的条带明显，适宜进一步做体系优化。
1～6：引物1～6扩增条带；7：内参基因Actin
图2 “秋天火焰”6对引物电泳图
2.3.2 确定退火温度 分别设50、51、56、58、60、63、65℃ 7个退火温度，将不同退火温度的PCR 产物于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测后发现： 当退火温度为50℃和51℃时出现特异性条带 （见图3）。表明50℃和51℃均适合‘秋天火焰’槭树UFGT基因PCR扩增。
图3 “秋天火焰”槭树叶片不同退火温度的PCR电泳图
2.3.3 PCR体系优化 将PCR反应循环中的变性时间缩短为30 s，循环次数改为30次，PCR检测结果显示，可得到UFGT基因片段的特异扩增条带。此改进措施可使PCR反应时间节省30 min左右，反应效率提高。
3 结论与讨论
PCR技术灵敏度高、特异性强、操作简便，是现代分子生物学家必不可少的研究工具。PCR扩增引物的合理设计与PCR反应体系的建立是克隆基因片段或全长序列成功的关键。其中，PCR反应体系的组分以及Taq聚合酶、模板cDNA浓度、Mg2+浓度、变性剂等都是重要的影响因素[9]。3.1 反应模板 成功的cDNA合成来自高质量的RNA，因而，提取的总RNA质量对整个PCR反应有重要影响[10]。本试验中，采用改良CTAB法提取的叶片总RNA质量较好，可作为槭树叶片总RNA提取的常规方法。3.2 引物
PCR引物设计的好坏，是能否获得高质量PCR产物的关键。设计的上游引物和下游引物必须与目的基因片段3′末端高度同源互补[11]。由于在GenBank中无法获得槭树UFGT基因的特异性引物，故以GenBank中登录的梨[12]等UFGT基因为参考，依据保守区碱基序列设计简并引物，然后进行PCR扩增。由于设计简并引物碱基序列的不确定性，引物特异性会有所降低，使PCR扩增的难度加大，反应底物浓度以及其它条件都要摸索。最终筛选出引物1适合进行下一步的体系优化。
3.3 退火温度
退火温度是影响RT-PCR特异性的较重要因素，与引物的长度和G+C 的含量密切相关[13]。若温度过高，设计引物与模板DNA 亲和力较小，得不到扩增产物；温度过低会引起非特异性扩增，因此，一般是在引物Tm值允许范围内，选择较高的退火温度，这样可提高RT-PCR反应的特异性。本研究结果表明，“秋天火焰”槭树适宜的退火温度是50℃和51℃。
3.4 循环次数
PCR循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度。一般选在30～40次之间，PCR循环次数越多，非特异性产物随之增多。在试验中，为提高PCR反应效率，30个循环便可达到较理想的扩增效果。
综上所述，槭树叶片UFGT基因的最佳PCR体系为：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，Taq酶 0.2 μl，cDNA 2 μl，灭菌蒸馏水 14.3 μl。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，51℃退火20 s，72℃延伸20 s，30个循环；72℃保温10 min。
参 考 文 献：
[1] Lister C E， Lancaster J E.Phenylalanine ammonialyase （PAL） activity and its relationship to anthocyanin and flavoniod levels in New Zealand-grown apple cultivars[J].Journal of the American Society for Horticulture Science， 1996，12（2）： 281-285.
[2] Boss P K，Davies C，Robinson S P.Analysis of the expression anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv.Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant Physiol.， 1996， 111： 1059-1066.
[3] Boss P K， Davies C， Robinson S P.（下转第6页）
山 东 农 业 科 学 2013，45（3）：4～6Shandong Agricultural Sciences
山 东 农 业 科 学第45卷第3期方志军等：玉米器官大小相关基因SMO2的鉴定和特征分析
收稿日期：2012-09-21
关键词：槭树；UFGT；RT-PCR
中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0001-04
彩叶树种的叶色表达是遗传因素和外部环境（光照、温度、水分和矿物质营养）共同作用的结果，二者通过改变树种叶片中各种色素的种类、含量以及分布形成了多彩的叶片。彩叶树种叶片呈现彩色的直接原因就是叶片中的色素种类和比例发生了变化。类黄酮糖基转移酶（UDP glucose-flavonoid-3-o-glycosyltranferase，UFGT） 是花青苷合成途径的最后一个酶，它使不稳定的花青素转变成稳定的花青苷[1]，并且该酶催化多种花青苷，甚至可以催化黄酮醇的糖苷化。Boss等以黑色果皮的Shiraz葡萄品种的几种不同组织为试材，检测花青苷生物合成的几个相关基因的表达情况，发现只有UFGT基因在果皮上特异表达，而其它的基因在各组织中均有表达；UFGT基因在有色葡萄中表达，而在白葡萄皮中不表达，说明UFGT基因是葡萄皮着色的关键基因[2，3]。
槭树是重要的秋季色叶树种，在世界各地园林景观中广泛应用。目前对其研究主要集中在栽培[4]、酶活性[5]、光合日变化[6，7]等方面，关于槭树叶色表达相关基因克隆方面的研究则较少。本研究以槭树秋季叶片为试材，对扩增UFGT基因的RT-PCR反应体系进行优化，从而建立起高效特异的槭树叶片UFGT基因扩增PCR体系。
1 材料与方法1.1 材料
试验于2011年11月在山东省果树研究所进行，以槭树品种“秋天火焰”（Acer×freemanii‘Autumn Blaze’）的秋季变色叶片为试材，采自山东省果树研究所彩叶树种种质资源圃。于11月份采集叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80℃冰箱中备用。1.2 试剂
CTAB、SDS、EDTA、NaCl、PVP、LiCl、DEPC、Tris碱、巯基乙醇、蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、琼脂糖、琼脂粉等为进口分析纯试剂；异戊醇、氯仿、无水乙醇等为国产分析纯试剂；PCR kit、cDNA kit；PCR引物合成由上海生工生物技术公司进行。玻璃器皿于180℃烘烤8 h，塑料制品等用0.1% DEPC水浸泡过夜后高压灭菌。
由于RNA在RNA酶的作用下非常容易降解，RNA 提取中所用的溶液除Tris外，均用0.1% DEPC水处理并高压灭菌，含Tris的溶液用经高压灭菌的DEPC水直接配制。1.3 RT-PCR体系的建立
1.3.1 RNA提取及反转录 总RNA提取参考招雪晴等[8]的方法，采用改良CTAB法提取，将提取到的总RNA用cDNA反转录试剂盒进行反转录。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度计测量OD值。
1.3.2 UFGT基因的引物设计 根据GenBank中（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）登录的相关物种的UFGT基因的保守序列设计6对简并引物。
1.3.3 PCR 反应体系优化 （1）引物筛选：以反转录后的cDNA为模板，采用不同的引物进行PCR扩增，以筛选最佳引物。采用25 μl的反应体系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl，Taq酶 0.2 μl，灭菌蒸馏水 14.3 μl。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，56℃退火20 s， 72℃延伸20 s，35个循环；72℃保温10 min。
（2）最佳退火温度的确定：反应体系不变，采用筛选出的引物，设置不同的退火温度（50、51、56、58、60、63、65℃）进行梯度PCR，以确定最佳的退火温度。
（3）PCR反应体系的进一步优化：确定了最佳引物和最佳退火温度后，通过缩短变性时间、减少循环次数等措施进一步对得到的PCR反应体系进行优化。
2 结果与分析2.1 总RNA的制备
利用改良的CTAB法提取槭树叶片的RNA，如图1所示，测量其OD值，结果为2.01，表明蛋白污染少；用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，28S、18S、5S条带较清晰，没有降解现象。说明所提取的RNA纯度和完整性较好，无DNA污染，符合cDNA合成的要求。
2.3 PCR 反应体系优化
2.3.1 最佳筛选引物 对设计的6对引物进行常规PCR扩增，筛选最佳的引物序列。由图2看出，引物1的条带明显，适宜进一步做体系优化。
1～6：引物1～6扩增条带；7：内参基因Actin
图2 “秋天火焰”6对引物电泳图
2.3.2 确定退火温度 分别设50、51、56、58、60、63、65℃ 7个退火温度，将不同退火温度的PCR 产物于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测后发现： 当退火温度为50℃和51℃时出现特异性条带 （见图3）。表明50℃和51℃均适合‘秋天火焰’槭树UFGT基因PCR扩增。
图3 “秋天火焰”槭树叶片不同退火温度的PCR电泳图
2.3.3 PCR体系优化 将PCR反应循环中的变性时间缩短为30 s，循环次数改为30次，PCR检测结果显示，可得到UFGT基因片段的特异扩增条带。此改进措施可使PCR反应时间节省30 min左右，反应效率提高。
3 结论与讨论
PCR技术灵敏度高、特异性强、操作简便，是现代分子生物学家必不可少的研究工具。PCR扩增引物的合理设计与PCR反应体系的建立是克隆基因片段或全长序列成功的关键。其中，PCR反应体系的组分以及Taq聚合酶、模板cDNA浓度、Mg2+浓度、变性剂等都是重要的影响因素[9]。3.1 反应模板 成功的cDNA合成来自高质量的RNA，因而，提取的总RNA质量对整个PCR反应有重要影响[10]。本试验中，采用改良CTAB法提取的叶片总RNA质量较好，可作为槭树叶片总RNA提取的常规方法。3.2 引物
PCR引物设计的好坏，是能否获得高质量PCR产物的关键。设计的上游引物和下游引物必须与目的基因片段3′末端高度同源互补[11]。由于在GenBank中无法获得槭树UFGT基因的特异性引物，故以GenBank中登录的梨[12]等UFGT基因为参考，依据保守区碱基序列设计简并引物，然后进行PCR扩增。由于设计简并引物碱基序列的不确定性，引物特异性会有所降低，使PCR扩增的难度加大，反应底物浓度以及其它条件都要摸索。最终筛选出引物1适合进行下一步的体系优化。
3.3 退火温度
退火温度是影响RT-PCR特异性的较重要因素，与引物的长度和G+C 的含量密切相关[13]。若温度过高，设计引物与模板DNA 亲和力较小，得不到扩增产物；温度过低会引起非特异性扩增，因此，一般是在引物Tm值允许范围内，选择较高的退火温度，这样可提高RT-PCR反应的特异性。本研究结果表明，“秋天火焰”槭树适宜的退火温度是50℃和51℃。
3.4 循环次数
PCR循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度。一般选在30～40次之间，PCR循环次数越多，非特异性产物随之增多。在试验中，为提高PCR反应效率，30个循环便可达到较理想的扩增效果。
综上所述，槭树叶片UFGT基因的最佳PCR体系为：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，上下游引物各2 μl，Taq酶 0.2 μl，cDNA 2 μl，灭菌蒸馏水 14.3 μl。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，51℃退火20 s，72℃延伸20 s，30个循环；72℃保温10 min。
参 考 文 献：
[1] Lister C E， Lancaster J E.Phenylalanine ammonialyase （PAL） activity and its relationship to anthocyanin and flavoniod levels in New Zealand-grown apple cultivars[J].Journal of the American Society for Horticulture Science， 1996，12（2）： 281-285.
[2] Boss P K，Davies C，Robinson S P.Analysis of the expression anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L.cv.Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J].Plant Physiol.， 1996， 111： 1059-1066.
[3] Boss P K， Davies C， Robinson S P.（下转第6页）
山 东 农 业 科 学 2013，45（3）：4～6Shandong Agricultural Sciences
山 东 农 业 科 学第45卷第3期方志军等：玉米器官大小相关基因SMO2的鉴定和特征分析
收稿日期：2012-09-21