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目的 构建靶向蛋白激酶B(PKB/Akt)基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响.方法 针对大鼠PKB/Akt基因序列(NM_033230)设计多个短发夹环RNA(shRNA)序列,化学合成法合成单链寡核苷酸序列,pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLKIN,脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB/Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体,感染血管平滑肌细胞(VSMC),Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)等表达的变化,流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化,噻唑盐(MTT)比色法检测VSMC增殖活性的改变.结果 shRNA序列经T载体克隆,酶切确定该片段为PKB/Akt基因shRNA序列;感染VSMC,证实其能够显著抑制PKB/Akt的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期.结论 成功构建PKB/Akt基因逆转录病毒shRNA载体,感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖。