【摘 要】
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[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium (Linn.) Sw ]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系.[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因
【机 构】
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南昌大学生命科学与食品工程学院,江西南昌,330031
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[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium (Linn.) Sw ]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系.[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为:DNA浓度(ng/μl)=OD260×50×稀释倍数.计算DNA获得率(DNA量/所用叶片量×100%).对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素(DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2+和dNTPs)逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系.[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25 μl PCR反应体积中,2.5 μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl2,240 ng模板DNA,160 μmol/L dNTPs,1.25 U Taq DNA聚合酶,0.4 μmol/L引物,双蒸水15.78 μl.最佳扩增程序为:94 ℃预变性5 min,然后进行40个循环:94 ℃变性30 s,50～60 ℃退火(退火温度随引物不同而定) 30 s,72 ℃延伸50 s,72 ℃延伸7 min.[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础.
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