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摘要 [目的]研究熱应激对黄羽肉鸡生长性能的影响。[方法]对新广黄公鸡和怀乡公鸡进行热应激处理，应用荧光定量PCR法检测UQCRB基因在新广黄公鸡和怀乡公鸡心脏组织中的表达水平，分析其对黄羽肉鸡体重、心脏相对重和心脏UQCRB基因相对表达量的影响。[结果]新广黄公鸡和怀乡公鸡21、28 d体重以及28 d心脏绝对重显著高于怀乡公鸡（P<0.05），2种公鸡心脏相对重差异不显著。28 d试验组新广黄公鸡的体重显著低于对照组（P<0.05）。新广黄公鸡21 d心脏UQCRB基因的相对表达量显著高于怀乡公鸡（P<0.05）。热应激显著降低了新广黄公鸡28 d心脏UQCRB基因的相对表达量（P<0.05）。[结论]心脏UQCRB基因表达与黄羽肉鸡生长速度相关，在肉鸡其他组织器官的表达有待进一步研究。
关键词 黄羽肉鸡;热应激;心脏;UQCRB;基因表达
中图分类号 S813文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）16-0102-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.029
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Effects of Heat Stress on the Expression of UQCRB Gene in Heart of Yellow feather Broilers
ZHANG Quan，ZHANG Bo hai，YANG Zhi cong et al （Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）
Abstract [Objective]To study the effects of heat stress on the growth performance of yellow feather broilers.[Method] The heat stress treatment were conducted on Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression level of UQCRB gene in the heart tissues of Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.The effects of heat stress treatment on the body weight，the relative weight of heart and the relative expression of UQCRB gene in the heart of yellow feather broilers were analyzed.[Result]The body weight on the 21st，28th day，and heart weight on the 28th day of Xinguanghuang cock were significantly higher than those of Huaixiang cock （P< 0.05），but the relative weight of heart had no significant difference between Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.The body weight of Xinguanghuang cock on the 28th day in test group was significantly lower than that in control group （P<0.05）. The relative expression of UQCRB gene in the heart of Xinguanghuang cock on the21st day was significantly higher than that in Huaixiang cock （P<0.05）. Heat stress significantly reduced the relative expression of UQCRB gene in the heart of Xinguanghuang cock （P<0.05）.[Conclusion]The expression of UQCRB gene in the heart was related to the growth rate of yellow feather broilers.The expression of UQCRB gene in other tissues of yellow feather broilers needs further study. Key words Yellow feather broilers;Heat stress;Heart;UQCRB;Gene expression
高环境温度对生长迅速的肉鸡影响较大[1]，尤其是这些快大型肉鸡的体重[2]。黄羽肉鸡是亚洲特别是我国深受欢迎的家禽品种，其生长速度慢于商品肉仔鸡，具有独特的肉味。心脏是高能量依赖性器官，特别容易受到氧化磷酸化障碍的影响，导致氧化磷酸化疾病[3-4]。以往对肉鸡的一些研究表明，快速生长的肉鸡会出现左心室损伤的症状[5]，而左心室衰竭会导致抽血功能丧失[6]。线粒体呼吸链酶系统代谢异常导致机体氧化磷酸化障碍，三磷酸腺苷（ATP）产生减少。线粒体呼吸链包括5种酶复合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V），辅酶Q-细胞色素C还原酶结合蛋白（ubiquinol cytochrome c reducatase binding protein，UQCRB，NM_001326494）是线粒体呼吸链复合体Ⅲ的亚单元，分子量为13.4 ku[7]。UQCRB基因在诱导血管生成和线粒体介导的代谢紊乱中发挥关键作用[8-9]。笔者从热应激反应角度出发，研究黄羽肉鸡体重、心脏相对重量及UQCRB基因在心脏中的表达量，分析热应激对黄羽肉鸡能量代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
新广黄公鸡和怀乡公鸡分别来自广东省佛山市新广畜牧发展有限公司和广东省信宜市盈富农业有限公司怀乡鸡保种场，各36只1日龄公雏。每品种随机分6组，每组6只，饲养管理条件一致，自由采食与饮水。每品种选取3组于22～28日龄时，每天进行热处理[（38±1）℃]8 h后降至室温[（25±1）℃]的条件下饲养（实验组）;每品种剩余3组于22-28日龄时处于室温[（25±1）℃]的条件下饲养（对照组）。分别测定21、28日龄新广黄公鸡和怀乡公鸡的体重。于28日龄时随机抽取每组公鸡各2只，每品种试验组和对照组各6只，颈部放血处死，测定心脏重并采集心脏左心室组织于液氮中保存，用于提取总RNA。
1.2 总RNA提取与逆转录
鸡心脏组织总RNA提取参照Trizol试剂说明书的操作步骤进行，RNA浓度和纯度使用Nanodrop紫外分光光度计检测，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，根据BeyoRTTM Ⅱ cDNA合成试剂盒说明书进行RNA逆转录，将获得的cDNA置于-20 ℃下用于荧光定量PCR检测。
1.3 引物设计与合成
根据NCBI网站中鸡UQCRB和GAPDH基因mRNA序列（NM_001326494.1和NM_204305.1），采用引物在线设计软件Primer 3（http：//primer3.ut.ee）设计引物，引物序列信息见表1。引物由广州金唯智生物科技公司合成。
1.4 荧光定量PCR
运用SYBR Green I 染料法，参照BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix试剂盒说明书进行荧光定量
PCR检测，以GAPDH为内参基因，检测UQCRB基因表达量。荧光定量PCR反应体系如下：2×SYBR Green I PCR Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，500 ng/ μL cNDA 1 μL，加RNase free Water至15 μL。PCR反应条件如下： 95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。
1.5 数据统计与分析 使用SPSS 19.0统计软件的Two way ANOVA分析黄羽肉鸡体重和心脏相对重量的差异显著性。UQCRB基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，使用SPSS 19.0统计软件One way ANOVA分析其显著性。试验结果均以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 热应激对黄羽肉鸡体重和心脏的影响
由表2可知，新广黄公鸡21、28 d体重以及28 d心脏绝对重量均显著高于怀乡公鸡（P<0.05），但2种鸡的心脏相对重量差异不显著。热应激显著降低28 d新广黄公鸡的体重（P<0.05），对28 d怀乡公鸡体重的影响不显著;热应激显著降低了28 d新广黄公鸡和怀乡公鸡的心脏绝对重量（P<0.05），但2种鸡的心脏相对重量差异不显著。这表明高温环境显著影响快速型黄羽鸡的生长速度，对慢速型黄羽鸡的影响不显著，对黄羽鸡心脏相对重无显著影响。
2.2 热应激对黄羽肉鸡心脏UQCRB基因相对表达量的影响
热应激对黄羽肉鸡心脏UQCRB基因相对表达量的影响见图1。从图1可以看出，新广黄公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量显著高于怀乡公鸡（P<0.05）;熱应激显著降低了新广黄公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量（P<0.05），对怀乡公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量影响不显著 （P>0.05）。这表明心脏UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡生长速度相关。 3 討论与结论
热应激使家禽生理机能紊乱，表现为体重降低、生长缓慢，是影响家禽生长性能的主要因素之一[10]。研究表明，持续热应激显著降低了黄羽肉鸡的生产性能，随着环境温度的升高，日增重显著下降[11]。耐热型品系AIL鸡[12]暴露在热环境下，7 d的体重增重率为58.9%[13]。在热应激下，家禽生长性能的降低与机体组织器官的各种变化有关，这些器官变化包括肠道受损、相关免疫器官和心脏的相对重减轻[14]。该研究发现，新广黄公鸡在7 d热应激条件下，体重增长约60%，对心脏相对重的影响不显著，表明在高温环境下新广黄公鸡具有一定的抗热应激能力，心脏生理发育正常[15]。
UQCRB是线粒体呼吸链复合体Ⅲ的亚单元，是线粒体能量代谢相关基因。氧化磷酸化电子传递链的功能异常会导致线粒体呼吸链功能障碍，UQCRB基因在诱导血管生成和线粒体介导的代谢紊乱中发挥着关键作用[8-9]。该研究中心脏UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡的生长速度呈正相关，且相关性达到显著水平。中快速型黄羽肉鸡心脏UQCRB基因的相对表达量因受热环境的影响而显著下降，从而导致生长速度减慢;慢速型黄羽肉鸡心脏UQCRB基因的相对表达量受热应激的影响，但其生长速度差异不显著。
热应激显著降低了新广黄公鸡28 d体重及心脏UQCRB基因的相对表达量，但其对怀兴公鸡无显著影响。这表明心脏中UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡的生长速度有关，而其在黄羽肉鸡其他组织器官中的表达则有待进一步 研究。
参考文献
[1] CHENG C Y，TU W L，CHEN C J，et al.Functional genomics study of acute heat stress response in the small yellow follicles of layer type chickens[J].Scientific reports，2018，8（1）：1-11.
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[4] FINSTERER J，KOTHARI S.Cardiac manifestations of primary mitochondrial disorders[J].Int J Cardiol，2014，177（3）：754-763.
[5] OLKOWSKI A A.Pathophysiology of heart failure in broiler chickens：Structural，biochemical，and molecular characteristics[J].Poultry science，2007，86（5）：999-1005.
[6] BAGHBANZADEH A，DECUYPERE E.Ascites syndrome in broilers：Physiological and nutritional perspectives[J].Avian pathology，2008，37（2）： 117-126.
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[9] CHANG J，JUNG H J，PARK H J，et al.Cell permeable mitochondrial ubiquinol cytochrome c reductase binding protein induces angiogenesis in vitro and in vivo[J].Cancer Lett，2015，366（1）：52-60.
[10] 鐘光，邵丹，施寿荣，等.循环热应激对黄羽肉鸡呼吸机能、生长性能和肝脏抗氧化功能的影响[J].动物营养学报，2018，30（3）： 947-952.
[11] 郭天宇，王江水，李凯旋，等.环境温度对黄羽肉鸡后期生产性能、消化功能和热应激相关指标的影响[J].中国畜牧杂志，2018，54（8）：107-111.
[12] DEEB N，LAMONT S J.Genetic architecture of growth and body composition in unique chicken populations[J].Journal of heredity，2002，93（2）：107-118.
[13] VAN GOOR A，BOLEK K J，ASHWELL C M，et al.Identification of quantitative trait loci for body temperature，body weight，breast yield，and digestibility in an advanced intercross line of chickens under heat stress[J].Genetics selection evolution，2015，47（1）：1-13.
[14] ZHANG J B，SCHMIDT C J，LAMONT S J.Transcriptome analysis reveals potential mechanisms underlying differential heart development in fast- and slow-growing broilers under heat stress[J].BMC Genomics，2017，18（1）：1-15.
[15] VAN DE VENL J F，VAN WAGENBERG A V，DECUYPERE E，et al.Perinatal broiler physiology between hatching and chick collection in 2 hatching systems[J].Poultry science，2013，92（4）：1050-1061.
关键词 黄羽肉鸡;热应激;心脏;UQCRB;基因表达
中图分类号 S813文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）16-0102-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.029
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Effects of Heat Stress on the Expression of UQCRB Gene in Heart of Yellow feather Broilers
ZHANG Quan，ZHANG Bo hai，YANG Zhi cong et al （Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）
Abstract [Objective]To study the effects of heat stress on the growth performance of yellow feather broilers.[Method] The heat stress treatment were conducted on Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression level of UQCRB gene in the heart tissues of Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.The effects of heat stress treatment on the body weight，the relative weight of heart and the relative expression of UQCRB gene in the heart of yellow feather broilers were analyzed.[Result]The body weight on the 21st，28th day，and heart weight on the 28th day of Xinguanghuang cock were significantly higher than those of Huaixiang cock （P< 0.05），but the relative weight of heart had no significant difference between Xinguanghuang cock and Huaixiang cock.The body weight of Xinguanghuang cock on the 28th day in test group was significantly lower than that in control group （P<0.05）. The relative expression of UQCRB gene in the heart of Xinguanghuang cock on the21st day was significantly higher than that in Huaixiang cock （P<0.05）. Heat stress significantly reduced the relative expression of UQCRB gene in the heart of Xinguanghuang cock （P<0.05）.[Conclusion]The expression of UQCRB gene in the heart was related to the growth rate of yellow feather broilers.The expression of UQCRB gene in other tissues of yellow feather broilers needs further study. Key words Yellow feather broilers;Heat stress;Heart;UQCRB;Gene expression
高环境温度对生长迅速的肉鸡影响较大[1]，尤其是这些快大型肉鸡的体重[2]。黄羽肉鸡是亚洲特别是我国深受欢迎的家禽品种，其生长速度慢于商品肉仔鸡，具有独特的肉味。心脏是高能量依赖性器官，特别容易受到氧化磷酸化障碍的影响，导致氧化磷酸化疾病[3-4]。以往对肉鸡的一些研究表明，快速生长的肉鸡会出现左心室损伤的症状[5]，而左心室衰竭会导致抽血功能丧失[6]。线粒体呼吸链酶系统代谢异常导致机体氧化磷酸化障碍，三磷酸腺苷（ATP）产生减少。线粒体呼吸链包括5种酶复合物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V），辅酶Q-细胞色素C还原酶结合蛋白（ubiquinol cytochrome c reducatase binding protein，UQCRB，NM_001326494）是线粒体呼吸链复合体Ⅲ的亚单元，分子量为13.4 ku[7]。UQCRB基因在诱导血管生成和线粒体介导的代谢紊乱中发挥关键作用[8-9]。笔者从热应激反应角度出发，研究黄羽肉鸡体重、心脏相对重量及UQCRB基因在心脏中的表达量，分析热应激对黄羽肉鸡能量代谢的影响。
1 材料与方法
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新广黄公鸡和怀乡公鸡分别来自广东省佛山市新广畜牧发展有限公司和广东省信宜市盈富农业有限公司怀乡鸡保种场，各36只1日龄公雏。每品种随机分6组，每组6只，饲养管理条件一致，自由采食与饮水。每品种选取3组于22～28日龄时，每天进行热处理[（38±1）℃]8 h后降至室温[（25±1）℃]的条件下饲养（实验组）;每品种剩余3组于22-28日龄时处于室温[（25±1）℃]的条件下饲养（对照组）。分别测定21、28日龄新广黄公鸡和怀乡公鸡的体重。于28日龄时随机抽取每组公鸡各2只，每品种试验组和对照组各6只，颈部放血处死，测定心脏重并采集心脏左心室组织于液氮中保存，用于提取总RNA。
1.2 总RNA提取与逆转录
鸡心脏组织总RNA提取参照Trizol试剂说明书的操作步骤进行，RNA浓度和纯度使用Nanodrop紫外分光光度计检测，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，根据BeyoRTTM Ⅱ cDNA合成试剂盒说明书进行RNA逆转录，将获得的cDNA置于-20 ℃下用于荧光定量PCR检测。
1.3 引物设计与合成
根据NCBI网站中鸡UQCRB和GAPDH基因mRNA序列（NM_001326494.1和NM_204305.1），采用引物在线设计软件Primer 3（http：//primer3.ut.ee）设计引物，引物序列信息见表1。引物由广州金唯智生物科技公司合成。
1.4 荧光定量PCR
运用SYBR Green I 染料法，参照BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix试剂盒说明书进行荧光定量
PCR检测，以GAPDH为内参基因，检测UQCRB基因表达量。荧光定量PCR反应体系如下：2×SYBR Green I PCR Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，500 ng/ μL cNDA 1 μL，加RNase free Water至15 μL。PCR反应条件如下： 95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。
1.5 数据统计与分析 使用SPSS 19.0统计软件的Two way ANOVA分析黄羽肉鸡体重和心脏相对重量的差异显著性。UQCRB基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，使用SPSS 19.0统计软件One way ANOVA分析其显著性。试验结果均以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 热应激对黄羽肉鸡体重和心脏的影响
由表2可知，新广黄公鸡21、28 d体重以及28 d心脏绝对重量均显著高于怀乡公鸡（P<0.05），但2种鸡的心脏相对重量差异不显著。热应激显著降低28 d新广黄公鸡的体重（P<0.05），对28 d怀乡公鸡体重的影响不显著;热应激显著降低了28 d新广黄公鸡和怀乡公鸡的心脏绝对重量（P<0.05），但2种鸡的心脏相对重量差异不显著。这表明高温环境显著影响快速型黄羽鸡的生长速度，对慢速型黄羽鸡的影响不显著，对黄羽鸡心脏相对重无显著影响。
2.2 热应激对黄羽肉鸡心脏UQCRB基因相对表达量的影响
热应激对黄羽肉鸡心脏UQCRB基因相对表达量的影响见图1。从图1可以看出，新广黄公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量显著高于怀乡公鸡（P<0.05）;熱应激显著降低了新广黄公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量（P<0.05），对怀乡公鸡心脏UQCRB基因的相对表达量影响不显著 （P>0.05）。这表明心脏UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡生长速度相关。 3 討论与结论
热应激使家禽生理机能紊乱，表现为体重降低、生长缓慢，是影响家禽生长性能的主要因素之一[10]。研究表明，持续热应激显著降低了黄羽肉鸡的生产性能，随着环境温度的升高，日增重显著下降[11]。耐热型品系AIL鸡[12]暴露在热环境下，7 d的体重增重率为58.9%[13]。在热应激下，家禽生长性能的降低与机体组织器官的各种变化有关，这些器官变化包括肠道受损、相关免疫器官和心脏的相对重减轻[14]。该研究发现，新广黄公鸡在7 d热应激条件下，体重增长约60%，对心脏相对重的影响不显著，表明在高温环境下新广黄公鸡具有一定的抗热应激能力，心脏生理发育正常[15]。
UQCRB是线粒体呼吸链复合体Ⅲ的亚单元，是线粒体能量代谢相关基因。氧化磷酸化电子传递链的功能异常会导致线粒体呼吸链功能障碍，UQCRB基因在诱导血管生成和线粒体介导的代谢紊乱中发挥着关键作用[8-9]。该研究中心脏UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡的生长速度呈正相关，且相关性达到显著水平。中快速型黄羽肉鸡心脏UQCRB基因的相对表达量因受热环境的影响而显著下降，从而导致生长速度减慢;慢速型黄羽肉鸡心脏UQCRB基因的相对表达量受热应激的影响，但其生长速度差异不显著。
热应激显著降低了新广黄公鸡28 d体重及心脏UQCRB基因的相对表达量，但其对怀兴公鸡无显著影响。这表明心脏中UQCRB基因的相对表达量与黄羽肉鸡的生长速度有关，而其在黄羽肉鸡其他组织器官中的表达则有待进一步 研究。
参考文献
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[12] DEEB N，LAMONT S J.Genetic architecture of growth and body composition in unique chicken populations[J].Journal of heredity，2002，93（2）：107-118.
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