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摘 要：随着基因工程技术的发展和对抗体基因结构的深入研究，开发了第三代抗体—基因工程抗体，被广泛用于疾病的临床诊断、治疗和预防等领域。主要介绍基因工程抗体药物的研究进展。
关键词：人源化抗体;小分子抗体;抗体融合蛋白
基因工程抗体是利用基因工程方法，对编码抗体的基因进行重组、缺失、修改改型等，构建载体，在受体细胞中表达的新型抗体，保留了天然抗体的特异性和主要活性，去除了无关结构，降低或消除了人体对抗体的排斥反应;且分子较小，穿透力强，更容易达到病灶的核心部位，因此，它比天然抗体更有潜在的应用前景[1]。
1 人源化抗体
1.1 嵌合抗体
嵌合抗体（Chimeric Antibody）是应用DNA重组技术将鼠源单抗的V区基因与人免疫球蛋白的C区基因拼接后，构建成人-鼠嵌合的基因，插入适当质粒，导入骨髓瘤细胞中表达产生的抗体，属第一代人源化抗体。由于嵌合抗体保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，对人的免疫原性大幅度下降了，因此，在临床上具有良好的应用前景。1997年，第一个人源化单抗Rituxan经FDA批准上市，它是一个抗CD20的人鼠嵌合抗体，用于治疗非何杰氏恶性淋巴瘤。
1.2 改型抗体
改型抗体（Reshaped Antibody，RAb），又称“CDR移植抗体”，是利用基因工程技术，将人抗体可变区中互补性决定区（Complementarity Determining Region，CDR）氨基酸序列改换为鼠源单抗CDR序列，属于第二代人源化抗体。这种抗体可以使人单抗具有鼠源性单抗的特异性又保持人源抗体亲和力。改型抗体分子中鼠源部分只占很小比例，仅有9%的序列来源于鼠源单抗，可基本消除免疫原性。目前，抗体分子的人源化虽然取得了很大进展，但是改形抗体遇到的最大问题是抗体亲和力下降或丧失活性，原因可能是人抗体分子的框架区中的一些氨基酸与鼠抗CDR区不协调。
2 小分子抗体
2.1 Fab抗体
Fab片段由重链可变区VH区及第一恒定区CH1功能区与整个轻链以二硫键连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体是对Fab段进行改造而获得的基因工程抗体，即将抗体重链V区和CH1功能区的cDNA与轻链的cDNA连接，克隆到表达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达得到的小分子抗体。这种抗体属于单价抗体，只能结合一个抗原表位，其大小为完整IgG的1/3，易于穿过血管壁和组织屏障进入病灶，免疫原性强，可作为载体分子偶联多种药物及放射性同位素等用于肿瘤等疾病的导向性诊断和治疗，也可进一步加工改造用于制备基因工程F（ab’）2抗体形式。屈芫等[2]构建了抗hPRLR人源Fab抗体库，筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆，hPRLR特异性Fab抗体的获得为高表达PRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。
2.2 单链抗体
单链抗体（single chain antibody，scFv）是具有完整抗原结合活性的最小功能片段，是在DNA水平上将轻、重链可变区基因用一段适当的寡核苷酸链（linker）连接起来，使之在适当的生物体中表达成为一条单一的肽链，并折叠成只由重鏈和轻链可变区构成的一种新型抗体。scFv分子质量小，没有Fc片段，表现出了更好的组织穿透力，其药代动力学优于Fab抗体或IgG等完整抗体。单链抗体的优点是可通过包含体大量表达、易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白;亲和力高、特异性好;免疫原性低，用于人体几乎不会产生抗鼠反应;分子小、无Fc端，对肿瘤组织的穿透力强，可作为毒素、药物、放射性核素、细胞因子导向肿瘤的潜力分子。朱小影等[3]成功表达并纯化了抗慢性粒细胞白血病（CML）人源化单链抗体hscFv，经检测可与K562细胞表面抗原特异性结合，为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗提供了依据。倪长伟等[4]成功表达抗多药耐药相关蛋白3（MRP3）的单链抗体（scFv）与人源可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（sTRAIL）的融合蛋白质，该融合蛋白具有诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性，为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.
2.3 二硫键稳定抗体
二硫键稳定抗体（disulfied stablized Fv，dsFv）是在单链抗体基础上开发的新型基因工程抗体，它是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的各一个氨基酸残基突变为半胱氨酸，然后通过链间二硫键连接VH和VL形成的抗体。杨瑞梅等[5]构建、表达了抗狂犬病病毒（RV）的人源二硫键稳定单链抗体（dsFv），经检测具有良好的RV结合活性和体内外中和活性，有可能被用于暴露后狂犬病的预防。
2.4 单域抗体
单域抗体（Single Domain Antibody，SDA）是只含有V区的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，其分子质量仅为完整抗体分子的1/12。与Fab、scFv相比，其制备简单;分子小，更容易穿过靶组织，可有效地进入完整抗体无法到达的靶位点，如病毒的“峡谷”及肿瘤等，但亲和力大幅度下降，非特异性吸附有所增加。
2.5 双特异性抗体
双特异性抗体又称双功能抗体（Bifunction Alantibody，BFA），是指具有两种抗原结合特性的抗体。抗体的两个抗原结合部位分别结合两个不同的抗原，即结构上是双价的、功能上是单价的。目前研究较多的基因工程双特异性抗体是将同一抗体的VH和VL区分布在不同的肽链上，构成两种交联的scFv，即VHB-linker-VLA和VHA-linker-VLB。单独的scFv链不具备结合抗原的活性，它们从大肠杆菌共分泌后形成的异二聚体，则可同时识别并结合两种特异性抗原[6]。在制备抗体药物时，抗体的一个臂与靶细胞表面抗原结合，另一个臂与效应物（药物、酶或放射性核素等）结合，从而将功能效应物直接导向靶细胞，用于疾病的诊断和治疗，具有广泛的应用前景。 3 抗体融合蛋白
抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体分子片段与其他蛋白融合的产物，如抗体酶、免疫毒素、免疫细胞因子、免疫黏附素等，它们在治疗中有着良好的应用前景。这种抗体融合蛋白有多种不同的构建方式，如将scFv与某些细胞膜蛋白融合，可形成嵌合受体，赋予特定细胞结合某种抗原的能力;将Fab或scFv与其他生物活性蛋白（细胞因子、酶、毒素等）融合，就可将特定的生物学效应物导向靶部位;将非抗体蛋白与抗体分子的Fc段融合，可改善其药物动力学特性，并可使某些生物学活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。李红等[7]构建了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的融合基因，表达获得scFv-PE38KDEL，经鉴定该免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性，为血吸虫病治疗提供了一条新思路。Bruell等[8]制备了抗EGFR的425（scFv）-ETA融合蛋白，其可抑制移植了人胰腺癌细胞的裸鼠体内癌细胞的转移和肿瘤生长。Heuser等[9]构建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白，发现该融合蛋白能同时结合MUCI+肿瘤细胞和CD25+免疫效应细胞。体外实验还发现，该融合蛋白能刺激活化的T细胞增殖，介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。付勇等[10]构建了抗肝癌scFv-RC-Rnase融合基因，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶的融合蛋白—抗体酶，为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。
4 结语
随着分子生物学、分子免疫学的发展及噬菌体抗体库技术的成熟，越来越多的新型抗体分子将被创造出来。各种形式的基因工程抗体的成功制备，将为抗体药物的临床应用提供更广阔的前景。
[参考文献]
[1]李德山，任桂萍.基因工程制药[M].北京：化学工业出版社，2010.
[2]屈 芫，魏钦俊，姚 俊，等.人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定[J].免疫学杂志，2012，28（6）：489-496.
[3]朱小影，王 东，李身锋，等.抗慢性粒细胞白血病细胞人源化单链抗体的原核表达及其活性[J].中国生物制品学杂志，2012（7）：877-880.
[4]倪长伟，赵辰阳，郎 悦，等.抗MRP3单链抗体-sTRAIL融合蛋白诱导U251多形性胶质母细胞瘤凋亡[J].中国生物化学与分子生物学报，2012，28（8）：761-767.
[5]杨瑞梅，杨松涛，王承宇，等.狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测[J].微生物学报，2011，51（1）：98-104.
[6]FISCHER N.Bispecific antibodies：molecules that enable novel therapeutic strategies[J].Pathobiology，2007（74）：3-14.
[7]李 红，朱晓娟，顾春艳，等.抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建、表达及生物學活性鉴定[J].中国血吸虫病防治杂志，2010，22（2）：117-121.
[8]BRUELL D，STOCKER M，HUHN M，et al.The recombinant anti-EGF receptor immunotoxin 425（scFv）-ETA’ suppresses growth of a highly metastatic pancreatic carcinoma cell line[J].Int. J. Oncol.，2003，23（4）：1 179-1 186.
[9]HEUSER C，GANSER M，HOMBACH A，et al.An anti MUCI-antibody-interleukin-2 fusion protein that activates resting NK cells to lysis of MUCI-positivetumour cells[J].Bri. J. Cancer，2003（89）：1 130-1 139.
[10]付 勇，刘彦仿，苏 勤，等.人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达[J].生物技术通报，2003，14（5）：353-355.
关键词：人源化抗体;小分子抗体;抗体融合蛋白
基因工程抗体是利用基因工程方法，对编码抗体的基因进行重组、缺失、修改改型等，构建载体，在受体细胞中表达的新型抗体，保留了天然抗体的特异性和主要活性，去除了无关结构，降低或消除了人体对抗体的排斥反应;且分子较小，穿透力强，更容易达到病灶的核心部位，因此，它比天然抗体更有潜在的应用前景[1]。
1 人源化抗体
1.1 嵌合抗体
嵌合抗体（Chimeric Antibody）是应用DNA重组技术将鼠源单抗的V区基因与人免疫球蛋白的C区基因拼接后，构建成人-鼠嵌合的基因，插入适当质粒，导入骨髓瘤细胞中表达产生的抗体，属第一代人源化抗体。由于嵌合抗体保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性，对人的免疫原性大幅度下降了，因此，在临床上具有良好的应用前景。1997年，第一个人源化单抗Rituxan经FDA批准上市，它是一个抗CD20的人鼠嵌合抗体，用于治疗非何杰氏恶性淋巴瘤。
1.2 改型抗体
改型抗体（Reshaped Antibody，RAb），又称“CDR移植抗体”，是利用基因工程技术，将人抗体可变区中互补性决定区（Complementarity Determining Region，CDR）氨基酸序列改换为鼠源单抗CDR序列，属于第二代人源化抗体。这种抗体可以使人单抗具有鼠源性单抗的特异性又保持人源抗体亲和力。改型抗体分子中鼠源部分只占很小比例，仅有9%的序列来源于鼠源单抗，可基本消除免疫原性。目前，抗体分子的人源化虽然取得了很大进展，但是改形抗体遇到的最大问题是抗体亲和力下降或丧失活性，原因可能是人抗体分子的框架区中的一些氨基酸与鼠抗CDR区不协调。
2 小分子抗体
2.1 Fab抗体
Fab片段由重链可变区VH区及第一恒定区CH1功能区与整个轻链以二硫键连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体是对Fab段进行改造而获得的基因工程抗体，即将抗体重链V区和CH1功能区的cDNA与轻链的cDNA连接，克隆到表达载体后，在大肠杆菌等宿主中表达得到的小分子抗体。这种抗体属于单价抗体，只能结合一个抗原表位，其大小为完整IgG的1/3，易于穿过血管壁和组织屏障进入病灶，免疫原性强，可作为载体分子偶联多种药物及放射性同位素等用于肿瘤等疾病的导向性诊断和治疗，也可进一步加工改造用于制备基因工程F（ab’）2抗体形式。屈芫等[2]构建了抗hPRLR人源Fab抗体库，筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆，hPRLR特异性Fab抗体的获得为高表达PRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。
2.2 单链抗体
单链抗体（single chain antibody，scFv）是具有完整抗原结合活性的最小功能片段，是在DNA水平上将轻、重链可变区基因用一段适当的寡核苷酸链（linker）连接起来，使之在适当的生物体中表达成为一条单一的肽链，并折叠成只由重鏈和轻链可变区构成的一种新型抗体。scFv分子质量小，没有Fc片段，表现出了更好的组织穿透力，其药代动力学优于Fab抗体或IgG等完整抗体。单链抗体的优点是可通过包含体大量表达、易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白;亲和力高、特异性好;免疫原性低，用于人体几乎不会产生抗鼠反应;分子小、无Fc端，对肿瘤组织的穿透力强，可作为毒素、药物、放射性核素、细胞因子导向肿瘤的潜力分子。朱小影等[3]成功表达并纯化了抗慢性粒细胞白血病（CML）人源化单链抗体hscFv，经检测可与K562细胞表面抗原特异性结合，为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗提供了依据。倪长伟等[4]成功表达抗多药耐药相关蛋白3（MRP3）的单链抗体（scFv）与人源可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（sTRAIL）的融合蛋白质，该融合蛋白具有诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性，为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.
2.3 二硫键稳定抗体
二硫键稳定抗体（disulfied stablized Fv，dsFv）是在单链抗体基础上开发的新型基因工程抗体，它是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的各一个氨基酸残基突变为半胱氨酸，然后通过链间二硫键连接VH和VL形成的抗体。杨瑞梅等[5]构建、表达了抗狂犬病病毒（RV）的人源二硫键稳定单链抗体（dsFv），经检测具有良好的RV结合活性和体内外中和活性，有可能被用于暴露后狂犬病的预防。
2.4 单域抗体
单域抗体（Single Domain Antibody，SDA）是只含有V区的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，其分子质量仅为完整抗体分子的1/12。与Fab、scFv相比，其制备简单;分子小，更容易穿过靶组织，可有效地进入完整抗体无法到达的靶位点，如病毒的“峡谷”及肿瘤等，但亲和力大幅度下降，非特异性吸附有所增加。
2.5 双特异性抗体
双特异性抗体又称双功能抗体（Bifunction Alantibody，BFA），是指具有两种抗原结合特性的抗体。抗体的两个抗原结合部位分别结合两个不同的抗原，即结构上是双价的、功能上是单价的。目前研究较多的基因工程双特异性抗体是将同一抗体的VH和VL区分布在不同的肽链上，构成两种交联的scFv，即VHB-linker-VLA和VHA-linker-VLB。单独的scFv链不具备结合抗原的活性，它们从大肠杆菌共分泌后形成的异二聚体，则可同时识别并结合两种特异性抗原[6]。在制备抗体药物时，抗体的一个臂与靶细胞表面抗原结合，另一个臂与效应物（药物、酶或放射性核素等）结合，从而将功能效应物直接导向靶细胞，用于疾病的诊断和治疗，具有广泛的应用前景。 3 抗体融合蛋白
抗体融合蛋白是指利用基因工程技术将抗体分子片段与其他蛋白融合的产物，如抗体酶、免疫毒素、免疫细胞因子、免疫黏附素等，它们在治疗中有着良好的应用前景。这种抗体融合蛋白有多种不同的构建方式，如将scFv与某些细胞膜蛋白融合，可形成嵌合受体，赋予特定细胞结合某种抗原的能力;将Fab或scFv与其他生物活性蛋白（细胞因子、酶、毒素等）融合，就可将特定的生物学效应物导向靶部位;将非抗体蛋白与抗体分子的Fc段融合，可改善其药物动力学特性，并可使某些生物学活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。李红等[7]构建了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4单链抗体和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL的融合基因，表达获得scFv-PE38KDEL，经鉴定该免疫毒素与血吸虫可溶性虫卵抗原有较好的结合活性，为血吸虫病治疗提供了一条新思路。Bruell等[8]制备了抗EGFR的425（scFv）-ETA融合蛋白，其可抑制移植了人胰腺癌细胞的裸鼠体内癌细胞的转移和肿瘤生长。Heuser等[9]构建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白，发现该融合蛋白能同时结合MUCI+肿瘤细胞和CD25+免疫效应细胞。体外实验还发现，该融合蛋白能刺激活化的T细胞增殖，介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。付勇等[10]构建了抗肝癌scFv-RC-Rnase融合基因，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶的融合蛋白—抗体酶，为进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。
4 结语
随着分子生物学、分子免疫学的发展及噬菌体抗体库技术的成熟，越来越多的新型抗体分子将被创造出来。各种形式的基因工程抗体的成功制备，将为抗体药物的临床应用提供更广阔的前景。
[参考文献]
[1]李德山，任桂萍.基因工程制药[M].北京：化学工业出版社，2010.
[2]屈 芫，魏钦俊，姚 俊，等.人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定[J].免疫学杂志，2012，28（6）：489-496.
[3]朱小影，王 东，李身锋，等.抗慢性粒细胞白血病细胞人源化单链抗体的原核表达及其活性[J].中国生物制品学杂志，2012（7）：877-880.
[4]倪长伟，赵辰阳，郎 悦，等.抗MRP3单链抗体-sTRAIL融合蛋白诱导U251多形性胶质母细胞瘤凋亡[J].中国生物化学与分子生物学报，2012，28（8）：761-767.
[5]杨瑞梅，杨松涛，王承宇，等.狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测[J].微生物学报，2011，51（1）：98-104.
[6]FISCHER N.Bispecific antibodies：molecules that enable novel therapeutic strategies[J].Pathobiology，2007（74）：3-14.
[7]李 红，朱晓娟，顾春艳，等.抗日本血吸虫单链抗体免疫毒素的构建、表达及生物學活性鉴定[J].中国血吸虫病防治杂志，2010，22（2）：117-121.
[8]BRUELL D，STOCKER M，HUHN M，et al.The recombinant anti-EGF receptor immunotoxin 425（scFv）-ETA’ suppresses growth of a highly metastatic pancreatic carcinoma cell line[J].Int. J. Oncol.，2003，23（4）：1 179-1 186.
[9]HEUSER C，GANSER M，HOMBACH A，et al.An anti MUCI-antibody-interleukin-2 fusion protein that activates resting NK cells to lysis of MUCI-positivetumour cells[J].Bri. J. Cancer，2003（89）：1 130-1 139.
[10]付 勇，刘彦仿，苏 勤，等.人源化抗肝癌单链抗体与牛蛙核糖核酸酶融合基因的构建及表达[J].生物技术通报，2003，14（5）：353-355.