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[摘要] 目的 探讨Nogo受体拮抗剂NEP1-40对大鼠脊髓损伤后，对神经生长因子（NGF）蛋白表达的影响。 方法 取雌性SD大鼠，随机分成对照组、生理盐水治疗组和NEP1-40治疗组，每组10只。建立T10节段的大鼠脊髓半切损伤模型，分别注射生理盐水和NEP1-40；于术后不同时间点对各组大鼠行后肢运动功能BBB评分；免疫组织化学染色检测神经生长因子（NGF）的表达。 结果 术后3周时，NEP1-40治疗组的BBB评分高于生理盐水治疗组（P<0.05）；术后4周时，NEP1-40治疗组的BBB评分高于生理盐水治疗组（P<0.01）。与生理盐水治疗组相比，NEP1-40治疗组在治疗2周后的神经生长因子（NGF）蛋白表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 脊髓损伤后，NEP1-40可以增加神经生长因子（NGF）蛋白的表达，促进脊髓损伤后大鼠神经的再生。
[关键词] 脊髓损伤；Nogo受体拮抗剂；神经生长因子；再生
[中图分类号] R722.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）32-0027-03
[Abstract] Objective To discuss the effect of NEP1-40 on the expression of NGF in rats with spinal cord injury （SCI）. Methods 30 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into model control normal group（n=10）， saline treatment group（n=10） and NEP1-40 treatment group （n=10）. Establish the model of acute spinal cord injury in T10. Injection of saline and NEP1-40 respectively. At different time points after operation， 5 rats in each group were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） scale， and the expression of Nerve Growth Factor of the spinal cord were detected with immunohistochemistry. Results The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 3 weeks after SCI（P<0.05）， The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 4 weeks after SCI （P<0.01）. Compared with normal saline treatment group， the expression of NGF increased 2 weeks after SCI in NEP1-40 treatment group（P<0.05）. Conclusion NEP1-40 may promote the expression of NGF in spinal cord after SCI in order to improve neural regeneration in rats.
[Key words] Spinal cord injury； Nogo receptor antagonist； Nerve growth factor； Regeneration
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种致残与致死率很高的疾病，其治疗一直是神经损伤修复领域的难题[1]。Nogo蛋白是目前所知有效的神经轴突生长的抑制因子[2]。Nogo受体拮抗剂（Nogo extra cellular peptide，residues1-40，NEP1-40）是Nogo受体（Nogo receptor，NgR）竞争性拮抗剂，能拮抗中枢神经抑制因子与Nogo受体的结合，间接促进新生轴突的生长，是目前国内外研究的热点[3]。本研究主要观察大鼠急性脊髓损伤后NEP1-40对运动功能恢复的影响及对神经生长因子（NGF）蛋白表达的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物
重量200 g左右健康SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠30只，随机分成生理盐水治疗组（A组），NEP1-40治疗组（B组）和对照组（C组）。动物合格证号：SCXK（沪）2008000513655，由福建医科大学实验动物中心提供，研究时间2014年9月～2015年7月。
1.2 药品与试剂
Nogo受体拮抗剂NEP1-40：购自上海信裕生物科技有限公司。免疫组化试剂：兔抗人神经生长因子（NGF）相应抗体均购自于上海丽臣生物科技有限公司。
1.3 仪器
光学显微镜（Olympus，SZ61，日本），低温高速离心机（Thermo Sorvall RC-6 plus，美国），Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析系统，超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰），电子天平（Sartouris，M371137，德国）。
1.4 实验方法
1.4.1 脊髓损伤模型制备 采用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，切开皮肤、皮下组织，暴露脊柱，以T8棘突为中心，打开T8椎板，做T10脊髓的后半横断，损伤深度1.0 mm。置入硬脊膜下导管，固定导管，逐层缝合，模型制作完成。NEP1-40治疗组每天将NEP1-40 10 μL（0.4 μg/μL）通过导管注入蛛网膜下腔，连续注射4周，早、中、晚各一次，注射完后用10 μL生理盐水冲管，使药物完全进入蛛网膜下腔。术后前3 d注射青霉素4万U/只，防止感染。术后每日挤压膀胱，促使排尿，直至排尿反射形成。生理盐水治疗组每天注入生理盐水20 μL，对照组切开皮肤后缝合，未干预。 1.4.2 标本收集和切片制作 实验动物均于脊髓损伤后第1、2、3、4周时打开胸腔，经心脏灌注缓冲液冲洗组织内血液。取出脊髓组织，在4%多聚甲醛中固定约6 h，以30%蔗糖溶液浸泡，冰冻切片，厚度20 μm。
1.5 评价指标
1.5.1 后肢运动神经功能 评分用BBB评分法[4]于术后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周观察大鼠双后肢运动功能，并按后肢全瘫（0分）至后肢运动完全正常（21分）记录分数。
1.5.2 NGF蛋白表达的免疫组织化学方法及步骤 免疫组织化学染色严格按照试剂盒操作，每只大鼠随机5张切片。观察与计数方法：以胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，以Image-Pro Plus 6.0软件计算每张切片的阳性细胞数，该标本的阳性细胞数为每张片的平均阳性细胞个数。
1.6 统计学分析
采用SPSS20.0统计软件，计量资料用（x±s）表示，进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学观察
术后脊髓损伤的大鼠均呈现双后肢完全瘫痪，术后1周时，手术组大鼠后肢功能无明显恢复，随着观察时间延长，手术组动物的神经功能均有不同程度的恢复。术后1 d～2周，BBB评分NEP1-40治疗组（B组）与生理盐水治疗组（A组）组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；术后3周时，B组的BBB评分显著高于A组（P<0.05）；术后4周时，B组的BBB评分显著高于A组（P<0.05）。见表1。
2.2 NGF蛋白的表达
在第1周时，生理盐水治疗组（A组）与NEP1-40治疗组（B组）NGF蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与A组相比，B组在第2、3、4周的NGF蛋白表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与C组相比，A组、B组在不同时相点NGF蛋白表达水平明显降低，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见封三图1～封三图8、表2。
3 讨论
目前脊髓损伤的发病率正在逐年增加，对人们的健康和生活质量构成了重大的威胁。具有致残率高、花费高，病死率高的特点[5]。目前治疗脊髓损伤的主要方法有药物治疗和手术干预等，虽然有一定的疗效，但疗效甚微。患者不仅身心健康受到影响，也造成社会经济问题。
脊髓损伤后局部环境改变导致神经缺血、变性。脊髓轴突的再生由于髓磷脂被破坏、胶质细胞丢失等原因受到影响，脊髓损伤后难以恢复主要由于轴突再生抑制[6]。髓磷脂相关糖蛋白、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白、Nogo蛋白是三种目前已知的神经轴突再生抑制因子[7]。Nogo基因能够表达三种网状蛋白。三种蛋白均作用于共同的受体NgR（Nogo receptor，NgR），NgR是抑制某些神经轴突生长因子的关键靶点。NgR至少有3个亚单位构成，被激活后有阻止神经轴突生长的作用[8]。当作为结合体三种蛋白与NgR相结合，可以激活Rho-A，中止生长锥使神经轴突的生长受到抑制[9]。表达在神经元轴突中的Nogo-A分子质量大且是其中作用最重要的蛋白，Nogo-A抑制神经轴突生长，功能区由66个氨基酸组成，是发挥抑制作用的主要功能结构区。与位于神经轴突细胞膜表面的Nogo-66受体结合后，通过信号传导抑制神经轴突再生[10]。由Nogo基因表达的蛋白质产物与NgR复合物，是目前被世人认可的神经轴突生长抑制因子，在人的脊髓等部位的研究有所进展[11，12]。
NEP1-40是目前有效的NgR受体的竞争性抑制剂，同时具有营养神经的作用。GrandPré等[13]的实验结果显示，NEP1-40可以和NgR受体结合，使抑制神经轴突生长NgR受体的下游信号通路塌陷，从而促使脊髓损伤后轴突生长。
NGF是第一个被发现的典型的细胞因子，对神经轴突的生长具有重要的作用[14]。NGF通过与膜上的受体结合，通过信号传导系统发挥活性，同时具有营养神经的作用。当脊髓损伤后，神经系统会产生神经营养因子，以NGF作用尤为突出，从而对神经元的正常功能和结构进行维持和保护。机制可能是通过细胞内分泌和细胞旁分泌的形式，刺激轴突生长，在神经系统的修复中发挥不可替代的作用[15]。
本实验中，术后3周，NEP1-40治疗组BBB评分较生理盐水治疗组高（P<0.05）。术后4周，NEP1-40治疗组BBB评分较生理盐水治疗组高（P<0.01）。NEP1-40治疗组比生理盐水治疗组有更好的神经功能的恢复，说明NEP1-40治疗后的大鼠受损中枢神经系统轴突的生长及功能恢复更加有效。可能NEP1-40在脊髓损伤恢复中除了促进轴突生长以外，尚有其他作用。通过对NGF表达的免疫组化分析，术后1周NEP1-40治疗组与生理盐水治疗组差异无统计学意义（P>0.05）。术后2周后，NEP1-40治疗组阳性细胞数目多于生理盐水治疗组（P<0.05）。说明NEP1-40能促进脊髓神经元的生长。NEP1-40在大鼠脊髓损伤模型中的蛛网膜下腔的给药，导致了神经轴突的生长，促进了大鼠脊髓损伤后双下肢运动功能恢复。因此，Nogo蛋白与NgR为中枢神经系统损伤后神经轴突生长受到阻碍的主要结构。而NEP1-40通过竞争性与NgR结合，促进神经轴突生长通过损伤区，在中枢神经系统损伤的修复中发挥着关键的作用[16]。
随着药物、基因、细胞、高压氧[17]等治疗技术的发展，神经损伤后修复明显进步。已发展为综合的多技术、多学科疗法[18，19]。虽在一定程度上可缓解症状，但无法根本上恢复脊髓功能[20]。Teng等[21]观察到NEP1-40促进脊髓损伤后轴突再生效果确切，是目前研究脊髓损伤后促进神经再生的热点，相信在不久的将来，有一定的临床应用前景。
[参考文献]
[1] Martin Ginis KA，J rgensen S，Stapleton J. Exercise and sport for persons with spinal cord injury[J]. PMR，2012，4（11）：894-900. [2] Yu P，Huang L，Zou J，et al. Immunization with recombinant Nogo-66 receptor（NgR） promote saxonal regeneration and recovery of function after spinal cordinjury in rats[J].Neurobiol Dis，2008，32（3）：535-542.
[3] Li S，Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antago-nistpromotes recovery from spinal cordinjury[J].Neurosci，2003，23（10）：4219-4227.
[4] 熊春翔，宗少晖，曾高峰，等. 大鼠Alles脊髓损伤模型化建立及评价[J]. 广州医科大学学报，2011，28（2）：215-217.
[5] Li Shenghua，Guo Pingde，Wang Wenjing. Current situation and progression in the treatment of spinal cord injury[J].China J Orthop
[关键词] 脊髓损伤；Nogo受体拮抗剂；神经生长因子；再生
[中图分类号] R722.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）32-0027-03
[Abstract] Objective To discuss the effect of NEP1-40 on the expression of NGF in rats with spinal cord injury （SCI）. Methods 30 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into model control normal group（n=10）， saline treatment group（n=10） and NEP1-40 treatment group （n=10）. Establish the model of acute spinal cord injury in T10. Injection of saline and NEP1-40 respectively. At different time points after operation， 5 rats in each group were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） scale， and the expression of Nerve Growth Factor of the spinal cord were detected with immunohistochemistry. Results The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 3 weeks after SCI（P<0.05）， The scores of BBB were better in NEP1-40 treatment group than in normal saline treatment group 4 weeks after SCI （P<0.01）. Compared with normal saline treatment group， the expression of NGF increased 2 weeks after SCI in NEP1-40 treatment group（P<0.05）. Conclusion NEP1-40 may promote the expression of NGF in spinal cord after SCI in order to improve neural regeneration in rats.
[Key words] Spinal cord injury； Nogo receptor antagonist； Nerve growth factor； Regeneration
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种致残与致死率很高的疾病，其治疗一直是神经损伤修复领域的难题[1]。Nogo蛋白是目前所知有效的神经轴突生长的抑制因子[2]。Nogo受体拮抗剂（Nogo extra cellular peptide，residues1-40，NEP1-40）是Nogo受体（Nogo receptor，NgR）竞争性拮抗剂，能拮抗中枢神经抑制因子与Nogo受体的结合，间接促进新生轴突的生长，是目前国内外研究的热点[3]。本研究主要观察大鼠急性脊髓损伤后NEP1-40对运动功能恢复的影响及对神经生长因子（NGF）蛋白表达的影响，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物
重量200 g左右健康SD（Sprague-Dawley）雌性大鼠30只，随机分成生理盐水治疗组（A组），NEP1-40治疗组（B组）和对照组（C组）。动物合格证号：SCXK（沪）2008000513655，由福建医科大学实验动物中心提供，研究时间2014年9月～2015年7月。
1.2 药品与试剂
Nogo受体拮抗剂NEP1-40：购自上海信裕生物科技有限公司。免疫组化试剂：兔抗人神经生长因子（NGF）相应抗体均购自于上海丽臣生物科技有限公司。
1.3 仪器
光学显微镜（Olympus，SZ61，日本），低温高速离心机（Thermo Sorvall RC-6 plus，美国），Image-Pro Plus 6.0计算机图像分析系统，超净工作台（SW-CJ-1B，苏州安泰），电子天平（Sartouris，M371137，德国）。
1.4 实验方法
1.4.1 脊髓损伤模型制备 采用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，切开皮肤、皮下组织，暴露脊柱，以T8棘突为中心，打开T8椎板，做T10脊髓的后半横断，损伤深度1.0 mm。置入硬脊膜下导管，固定导管，逐层缝合，模型制作完成。NEP1-40治疗组每天将NEP1-40 10 μL（0.4 μg/μL）通过导管注入蛛网膜下腔，连续注射4周，早、中、晚各一次，注射完后用10 μL生理盐水冲管，使药物完全进入蛛网膜下腔。术后前3 d注射青霉素4万U/只，防止感染。术后每日挤压膀胱，促使排尿，直至排尿反射形成。生理盐水治疗组每天注入生理盐水20 μL，对照组切开皮肤后缝合，未干预。 1.4.2 标本收集和切片制作 实验动物均于脊髓损伤后第1、2、3、4周时打开胸腔，经心脏灌注缓冲液冲洗组织内血液。取出脊髓组织，在4%多聚甲醛中固定约6 h，以30%蔗糖溶液浸泡，冰冻切片，厚度20 μm。
1.5 评价指标
1.5.1 后肢运动神经功能 评分用BBB评分法[4]于术后1 d、3 d、1周、2周、3周、4周观察大鼠双后肢运动功能，并按后肢全瘫（0分）至后肢运动完全正常（21分）记录分数。
1.5.2 NGF蛋白表达的免疫组织化学方法及步骤 免疫组织化学染色严格按照试剂盒操作，每只大鼠随机5张切片。观察与计数方法：以胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性，以Image-Pro Plus 6.0软件计算每张切片的阳性细胞数，该标本的阳性细胞数为每张片的平均阳性细胞个数。
1.6 统计学分析
采用SPSS20.0统计软件，计量资料用（x±s）表示，进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学观察
术后脊髓损伤的大鼠均呈现双后肢完全瘫痪，术后1周时，手术组大鼠后肢功能无明显恢复，随着观察时间延长，手术组动物的神经功能均有不同程度的恢复。术后1 d～2周，BBB评分NEP1-40治疗组（B组）与生理盐水治疗组（A组）组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；术后3周时，B组的BBB评分显著高于A组（P<0.05）；术后4周时，B组的BBB评分显著高于A组（P<0.05）。见表1。
2.2 NGF蛋白的表达
在第1周时，生理盐水治疗组（A组）与NEP1-40治疗组（B组）NGF蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与A组相比，B组在第2、3、4周的NGF蛋白表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）；与C组相比，A组、B组在不同时相点NGF蛋白表达水平明显降低，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见封三图1～封三图8、表2。
3 讨论
目前脊髓损伤的发病率正在逐年增加，对人们的健康和生活质量构成了重大的威胁。具有致残率高、花费高，病死率高的特点[5]。目前治疗脊髓损伤的主要方法有药物治疗和手术干预等，虽然有一定的疗效，但疗效甚微。患者不仅身心健康受到影响，也造成社会经济问题。
脊髓损伤后局部环境改变导致神经缺血、变性。脊髓轴突的再生由于髓磷脂被破坏、胶质细胞丢失等原因受到影响，脊髓损伤后难以恢复主要由于轴突再生抑制[6]。髓磷脂相关糖蛋白、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白、Nogo蛋白是三种目前已知的神经轴突再生抑制因子[7]。Nogo基因能够表达三种网状蛋白。三种蛋白均作用于共同的受体NgR（Nogo receptor，NgR），NgR是抑制某些神经轴突生长因子的关键靶点。NgR至少有3个亚单位构成，被激活后有阻止神经轴突生长的作用[8]。当作为结合体三种蛋白与NgR相结合，可以激活Rho-A，中止生长锥使神经轴突的生长受到抑制[9]。表达在神经元轴突中的Nogo-A分子质量大且是其中作用最重要的蛋白，Nogo-A抑制神经轴突生长，功能区由66个氨基酸组成，是发挥抑制作用的主要功能结构区。与位于神经轴突细胞膜表面的Nogo-66受体结合后，通过信号传导抑制神经轴突再生[10]。由Nogo基因表达的蛋白质产物与NgR复合物，是目前被世人认可的神经轴突生长抑制因子，在人的脊髓等部位的研究有所进展[11，12]。
NEP1-40是目前有效的NgR受体的竞争性抑制剂，同时具有营养神经的作用。GrandPré等[13]的实验结果显示，NEP1-40可以和NgR受体结合，使抑制神经轴突生长NgR受体的下游信号通路塌陷，从而促使脊髓损伤后轴突生长。
NGF是第一个被发现的典型的细胞因子，对神经轴突的生长具有重要的作用[14]。NGF通过与膜上的受体结合，通过信号传导系统发挥活性，同时具有营养神经的作用。当脊髓损伤后，神经系统会产生神经营养因子，以NGF作用尤为突出，从而对神经元的正常功能和结构进行维持和保护。机制可能是通过细胞内分泌和细胞旁分泌的形式，刺激轴突生长，在神经系统的修复中发挥不可替代的作用[15]。
本实验中，术后3周，NEP1-40治疗组BBB评分较生理盐水治疗组高（P<0.05）。术后4周，NEP1-40治疗组BBB评分较生理盐水治疗组高（P<0.01）。NEP1-40治疗组比生理盐水治疗组有更好的神经功能的恢复，说明NEP1-40治疗后的大鼠受损中枢神经系统轴突的生长及功能恢复更加有效。可能NEP1-40在脊髓损伤恢复中除了促进轴突生长以外，尚有其他作用。通过对NGF表达的免疫组化分析，术后1周NEP1-40治疗组与生理盐水治疗组差异无统计学意义（P>0.05）。术后2周后，NEP1-40治疗组阳性细胞数目多于生理盐水治疗组（P<0.05）。说明NEP1-40能促进脊髓神经元的生长。NEP1-40在大鼠脊髓损伤模型中的蛛网膜下腔的给药，导致了神经轴突的生长，促进了大鼠脊髓损伤后双下肢运动功能恢复。因此，Nogo蛋白与NgR为中枢神经系统损伤后神经轴突生长受到阻碍的主要结构。而NEP1-40通过竞争性与NgR结合，促进神经轴突生长通过损伤区，在中枢神经系统损伤的修复中发挥着关键的作用[16]。
随着药物、基因、细胞、高压氧[17]等治疗技术的发展，神经损伤后修复明显进步。已发展为综合的多技术、多学科疗法[18，19]。虽在一定程度上可缓解症状，但无法根本上恢复脊髓功能[20]。Teng等[21]观察到NEP1-40促进脊髓损伤后轴突再生效果确切，是目前研究脊髓损伤后促进神经再生的热点，相信在不久的将来，有一定的临床应用前景。
[参考文献]
[1] Martin Ginis KA，J rgensen S，Stapleton J. Exercise and sport for persons with spinal cord injury[J]. PMR，2012，4（11）：894-900. [2] Yu P，Huang L，Zou J，et al. Immunization with recombinant Nogo-66 receptor（NgR） promote saxonal regeneration and recovery of function after spinal cordinjury in rats[J].Neurobiol Dis，2008，32（3）：535-542.
[3] Li S，Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antago-nistpromotes recovery from spinal cordinjury[J].Neurosci，2003，23（10）：4219-4227.
[4] 熊春翔，宗少晖，曾高峰，等. 大鼠Alles脊髓损伤模型化建立及评价[J]. 广州医科大学学报，2011，28（2）：215-217.
[5] Li Shenghua，Guo Pingde，Wang Wenjing. Current situation and progression in the treatment of spinal cord injury[J].China J Orthop