背景:间充质干细胞在骨髓中的含量很低,需进行体外分离纯化和大量增殖。目的:优化骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增的方法,拟提高骨髓间充质干细胞的获得率和扩增率。设计、实施及地点:以细胞为对象的观察实验,于2007-03/2008-02在南方医科大学珠江医院血液科实验室进行。材料:实验动物为6~8周龄清洁级雄性大鼠,体质量130~150g。方法:采用改进的贴壁法培养骨髓间充质干细胞:保留大鼠肱骨、股骨和胫骨,尽量将骨周边组织剔除干净,从而减少混杂的细胞;冲洗骨髓腔时,选用2.5mL的注射器,可以将紧贴骨髓腔壁的骨髓间充质干细胞吹洗下来,从而提升获得率;细胞换液时未全部倾去旧培养液,保留了1/4~1/5的旧培养液;采用"二传一"的方法将两瓶原代细胞分别消化后合为一瓶,保证传代时对细胞数目的要求,能避免细胞过度老化。主要观察指标:倒置光显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察,流式细胞术进行细胞周期分析,MTT法和克隆形成实验测定细胞P1和P5生长曲线和克隆形成能力,用流式细胞仪和碱性磷酸酶对培养进行细胞鉴定。结果:分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形。原代培养细胞传代后,细胞增殖速度较快,基本上三四天传代1次,随传代次数的增加细胞形态趋于一致细胞基本为成纤维细胞型。流式细胞术证明G0G1期的细胞约占80%以上。细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第五天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢、克隆能力降低。经流式细胞仪检测显示CD44、CD99阳性,CD45阴性,碱性磷酸酶试验为阳性。结论:采用改良的的方法获得了大量遗传性质均一、功能状态良好的骨髓间充质干细胞,并有效地提高了细胞的获得率和扩增率。