【摘 要】
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目的 构建人色素上皮衍生因子(human pigment epithelium-derived factor, hPEDF)慢病毒载体,包装过表达PEDF的慢病毒,构建过表达PEDF的人角质形成细胞(human keratinocyte,H
【机 构】
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空军军医大学第一附属医院整形外科,陕西西安710032
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目的 构建人色素上皮衍生因子(human pigment epithelium-derived factor, hPEDF)慢病毒载体,包装过表达PEDF的慢病毒,构建过表达PEDF的人角质形成细胞(human keratinocyte,HaCaT)的细胞株.方法 将PEDF基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-puro,构建pLVX-IRES-puro-PEDF慢病毒重组质粒并转染293T细胞,包装获得病毒上清,进行病毒扩增,收集病毒上清液,测定扩增后的病毒滴度.扩增后的病毒上清液以最佳感染复数感染体外培养的HaCaT细胞作为HaCaT-PEDF组(实验组),同时以含有空载体的慢病毒感染HaCaT细胞株作为HaCaT细胞组(对照组),扩增72 h后收集两组细胞及条件培养基,通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot,WB)技术检测各组细胞PEDF基因mRNA以及蛋白的表达情况,通过酶联免疫吸附试验检测两组细胞PEDF蛋白分泌情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、Sanger测序证实,成功构建了携带PEDF基因的重组慢病毒表达载体,且包装的慢病毒滴度可达1×107 pfu/ml.RT-PCR和WB检测结果显示,实验组细胞中PEDF的mRNA和蛋白均显著高于对照组(P＜0.05),并能分泌至细胞外.结论 成功构建了表达PEDF基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功感染HaCaT细胞,并高表达PEDF蛋白.
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