论文部分内容阅读
摘 要 通过设置不同碳源、氮源、温度、菌龄等对巴西橡胶树红根病病菌[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over.et Steinm]进行液体培养试验。结果表明：适合橡胶树红根病病菌菌丝生长的液体培养基配方为：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黄豆粉0.8%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%；最适培养温度是29℃，液体菌种菌龄为120 h，培养周期为240 h。
关键词 巴西橡胶树 ；橡胶灵芝 ；液体培养 ；优化
分类号 S432
橡胶树红根病是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害，病原菌为橡胶灵芝[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Steinm][1]，具有寄主较多[2]、潜伏期长[3]、在土壤中蔓延迅速[4]、对干胶产量影响严重等特点[5-6]。目前红根病在中国海南和云南植胶区普遍发生，发病严重的林段发病率达到40%，若没有及时处理，则死亡率为100%[7]。与固体培养相比，液体培养具有周期短、产量高等优点，能在短时间内获得大量菌丝体，便于开展分子生物学及病害防控方面的研究。本研究通过设置不同碳源、氮源、温度、菌龄等对橡胶灵芝进行液体培养试验，以筛选适合橡胶灵芝菌丝生长的培养基配方，为进一步提高菌丝体产量及开展相关研究提供有效参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
橡胶灵芝菌（G. pseudoferreum）GP1采自中国热带农业科学院试验场三队（海南省儋州市），由中国热带农业科学院橡胶研究所分离培养。
1.1.2 培养基
（1）活化培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7；（2）液体基础培养基：胰蛋白胨2%，葡萄糖4%，酵母粉0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。
1.2 方法
1.2.1 液体菌种的制备
取1块活化菌种接种于活化培养基平板上，于29℃培养168 h，切取1 mm×1 mm菌丝块转接于装有100 mL液体基础培养基的500 mL三角瓶中，每瓶20块，以29℃、160 r/min培养240 h。
1.2.2 液体培养生长曲线的测定
100 mL液体基础培养基中接种1/10体积的液体菌种，置于500 mL三角瓶中震荡培养，培养条件同1.2.1。接种48 h后开始取样测菌丝体生物量，每24 h取1次，直到第288 h，每次3个重复。
1.2.3 菌丝体生物量测定
将100 mL液体培养基中培养的红根菌菌丝体进行抽滤，以50℃烘干至恒重即为菌丝体生物量。
1.2.4 培养基碳、氮源优化试验
碳源选择3个因素，即葡萄糖、蔗糖、D-果糖，氮源为黄豆粉、酵母粉、玉米粉、蛋白胨，其他无机盐及维生素比例同1.1.2的（2）中液体基础培养基。培养条件和菌丝体生物量测定同1.2.2。利用正交设计助手3.1版设计L18（37）正交实验，各因素水平见表1，每个处理3次重复。
1.2.5 培养温度对菌丝体生物量的影响
培养温度设为23、25、27、29、31和33℃，每个处理3次重复，培养基使用1.2.4优化配方，接种、培养和菌丝体生物量测定同上。
1.2.6 菌种菌龄对菌丝体生物量的影响试验
液体菌种的菌龄分别为48、72、96、120、144和168 h，每个处理3次重复，培养温度为29℃，其他同1.2.5。
1.2.7 液体培养的菌丝体致病性验证试验
采用2种方法对橡胶树组培苗热研7-33-97进行接种试验，验证液体培养的菌丝体是否仍具有致病性。（1）浸根接种法：待橡胶灵芝菌液体培养168 h后，将无菌组培苗根部侵入培养液中，静置观察；（2）木屑菌棒接种法：将无菌组培苗种植于装有灭菌的木屑菌棒培养基质的玻璃瓶中[8]，种植1周后，将培养168 h的橡胶灵芝菌菌丝体接种至木屑菌棒培养基质中，培养观察。每种方法3次重复。
1.3 数据分析
用正交设计助手软件对正交试验所得数据进行分析，将其他数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 红根菌液体培养生长曲线
从图1的生长曲线中可以看出，该菌在液体培养基中培养24～240 h，生物量逐步上升，其中在48～168 h期间生长快速，呈直线增长，后期生长缓慢，240 h时菌丝体生物量达到最高值（1.41 g/100 mL），之后开始下降。
2.2 培养基碳、氮源优化
根据极差分析可知，7种碳、氮源对菌丝生长影响的大小依次为B>C>D>G>A>E=F，即葡萄糖>D-果糖>玉米粉>蛋白胨>蔗糖>酵母粉=黄豆粉（表2）。最佳组合配方是A1B2C2D1E3F2G3：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黄豆粉0.8%，蛋白胨1%。
2.3 培养温度对菌丝体生物量的影响
图2的结果表明，红根菌菌丝体在低于25℃、高于31℃的培养环境下生长缓慢，最适生长温度为29℃，该温度下菌丝体生物量可达2.05 g/100mL。
2.4 菌种菌龄对菌丝体生物量的影响
6种菌龄的菌种经接种培养后，菌丝体生物量差异不显著，其中菌龄120 h的生物量略高于其他5个供试菌龄（图3）。
2.5 液体培养的菌丝体致病性验证结果 利用浸根接种法静置接种10 d后，在培养液表面形成块状菌丝体并开始蔓延，逐渐侵染至组培苗根部，组培苗叶片开始黄化、萎蔫、脱落（图4A）；静置接种20 d，三角瓶培养液表面形成一整块菌丝体，菌丝侵染组培苗根部形成白色的菌膜（图4C）。利用木屑菌棒接种法接种20 d后，菌丝长满玻璃瓶，组培苗叶片出现黄化、萎蔫和脱落的症状（图4B）；接种30 d后，菌丝体侵染整个根部和部分根茎部，形成白色菌膜（图4D）。
3 讨论
本研究在前文报道橡胶树红根病病菌生物学特性[5]、其它担子菌培养基[9-13]以及前期实验基础上，选择适合橡胶树红根病病菌液体培养的碳氮源。通过正交试验极差分析，3种碳源中葡萄糖对菌丝生长影响最大，D-果糖和蔗糖次之；4种氮源中玉米粉对菌丝生长影响最大，随后依次是蛋白胨、酵母粉、黄豆粉。碳源的利用效率与前文报道略有不同，可能是固定培养基静置培养与液体培养基转动培养这2种培养方式的差异所致。最后综合得出了适合橡胶树红根病病菌液体培养的配方是：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黄豆粉0.8%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。本研究还对培养周期、培养温度和菌种菌龄等几个重要培养因素进行了单因素筛选，结果得出最适生长温度为29℃，低于25℃、高于31℃菌丝生长缓慢；菌种菌龄对菌丝体生物量影响不显著，其中菌龄120 h的菌丝体生物量达到最大值。由此确定最适合红根病病菌液体培养的条件为：液体菌种菌龄120 h，培养温度29℃，培养周期240 h。在以上培养基和培养条件下，红根病病菌菌丝体生物量最大可达2.11 g/（100 mL），远高于固体培养所得到的菌丝体生物量。试验表明，液体培养的菌丝体仍然具有较强的侵染力，橡胶灵芝液体培养的成功有利于红根病接种鉴定方法的改良及橡胶树红根病抗性鉴定评价体系的建立。同时，橡胶灵芝在现有的培养条件下，生长速度较其他灵芝菌[14-15]缓慢。因此，后续的研究仍需要在现有的培养基基础上，优化相关的微量元素及营养元素含量，进一步提高橡胶灵芝液体培养效果。
参考文献
[1] Nandris D， Nicole M， Geiger J P. Root rot diseases of rubber trees[J]. Plant Disease， 1987， 71（4）： 298-306.
[2] 丁雄飞，刘昌芬. 云南橡胶树灵芝分类研究[J]. 云南热作科技，1995，18（2）： 14-19.
[3] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州： 广东科技出版社，1987：294-300.
[4] 张运强，张辉强. 橡胶树红根病的蔓延速度及预测预报[J]. 热带作物学报，1998，19（1）：7-12.
[5] 张 贺，蒲金基，张 欣，等. 橡胶树红根病病原菌生物学培养特性[J]. 热带作物学报，2008，29（5）：632-635.
[6] 张运强，张辉强，邓晓东. 橡胶树红根病病原菌的鉴定[J]. 热带作物学报，1997，18（1）：16-23.
[7] 白建相，王 涓，黄 林，等. 云南河口垦区橡胶树根病普查及治理方法探讨[J]. 热带农业科技， 2008， 31（3）： 7-11.
[8] 高秀兵，李增平，李晓娜，等. 橡胶树几种根病的人工接种方法[J]. 热带作物学报，2010，31（4）：626-630.
[9] 任海霞，杨 鹏，曲 玲，等. 草菇液体菌种培养条件优化研究[J]. 山东农业科学，2014，46（1）：58-60.
[10] 王治江，高红中，王少秋，等. 杏鲍菇液体培养胞外酶活性研究[J]. 蔬菜，2014，（3）：69-71.
[11] 董玉兰，李书生，张丽萍，等. 白灵菇高活力液体菌种摇瓶发酵培养条件的优化[J]. 北方园艺，2014（6）：143-146.
[12] 王 红，郭成金. 正交设计法香菇菌丝体液体培养基的筛选[J]. 中国酿造，2013，32（4）：74-77.
[13] 肇 莹，肖 军，王 娜，等. 蓝莓菌根真菌液体培养条件的正交试验优化[J]. 湖北农业科学，2013，52（10）：2 268-2 269.
[14] 马 凤，刘 波，张跃新，等. 松杉灵芝液体培养条件优化试验[J]. 防护林科技，2013（12）：34-35.
[15] 夏 险，刘健勇，涂俊铭. 血芝深层液体培养研究初探[J]. 食用菌，2012（6）：11-12.
关键词 巴西橡胶树 ；橡胶灵芝 ；液体培养 ；优化
分类号 S432
橡胶树红根病是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害，病原菌为橡胶灵芝[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over. et Steinm][1]，具有寄主较多[2]、潜伏期长[3]、在土壤中蔓延迅速[4]、对干胶产量影响严重等特点[5-6]。目前红根病在中国海南和云南植胶区普遍发生，发病严重的林段发病率达到40%，若没有及时处理，则死亡率为100%[7]。与固体培养相比，液体培养具有周期短、产量高等优点，能在短时间内获得大量菌丝体，便于开展分子生物学及病害防控方面的研究。本研究通过设置不同碳源、氮源、温度、菌龄等对橡胶灵芝进行液体培养试验，以筛选适合橡胶灵芝菌丝生长的培养基配方，为进一步提高菌丝体产量及开展相关研究提供有效参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
橡胶灵芝菌（G. pseudoferreum）GP1采自中国热带农业科学院试验场三队（海南省儋州市），由中国热带农业科学院橡胶研究所分离培养。
1.1.2 培养基
（1）活化培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7；（2）液体基础培养基：胰蛋白胨2%，葡萄糖4%，酵母粉0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。
1.2 方法
1.2.1 液体菌种的制备
取1块活化菌种接种于活化培养基平板上，于29℃培养168 h，切取1 mm×1 mm菌丝块转接于装有100 mL液体基础培养基的500 mL三角瓶中，每瓶20块，以29℃、160 r/min培养240 h。
1.2.2 液体培养生长曲线的测定
100 mL液体基础培养基中接种1/10体积的液体菌种，置于500 mL三角瓶中震荡培养，培养条件同1.2.1。接种48 h后开始取样测菌丝体生物量，每24 h取1次，直到第288 h，每次3个重复。
1.2.3 菌丝体生物量测定
将100 mL液体培养基中培养的红根菌菌丝体进行抽滤，以50℃烘干至恒重即为菌丝体生物量。
1.2.4 培养基碳、氮源优化试验
碳源选择3个因素，即葡萄糖、蔗糖、D-果糖，氮源为黄豆粉、酵母粉、玉米粉、蛋白胨，其他无机盐及维生素比例同1.1.2的（2）中液体基础培养基。培养条件和菌丝体生物量测定同1.2.2。利用正交设计助手3.1版设计L18（37）正交实验，各因素水平见表1，每个处理3次重复。
1.2.5 培养温度对菌丝体生物量的影响
培养温度设为23、25、27、29、31和33℃，每个处理3次重复，培养基使用1.2.4优化配方，接种、培养和菌丝体生物量测定同上。
1.2.6 菌种菌龄对菌丝体生物量的影响试验
液体菌种的菌龄分别为48、72、96、120、144和168 h，每个处理3次重复，培养温度为29℃，其他同1.2.5。
1.2.7 液体培养的菌丝体致病性验证试验
采用2种方法对橡胶树组培苗热研7-33-97进行接种试验，验证液体培养的菌丝体是否仍具有致病性。（1）浸根接种法：待橡胶灵芝菌液体培养168 h后，将无菌组培苗根部侵入培养液中，静置观察；（2）木屑菌棒接种法：将无菌组培苗种植于装有灭菌的木屑菌棒培养基质的玻璃瓶中[8]，种植1周后，将培养168 h的橡胶灵芝菌菌丝体接种至木屑菌棒培养基质中，培养观察。每种方法3次重复。
1.3 数据分析
用正交设计助手软件对正交试验所得数据进行分析，将其他数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 红根菌液体培养生长曲线
从图1的生长曲线中可以看出，该菌在液体培养基中培养24～240 h，生物量逐步上升，其中在48～168 h期间生长快速，呈直线增长，后期生长缓慢，240 h时菌丝体生物量达到最高值（1.41 g/100 mL），之后开始下降。
2.2 培养基碳、氮源优化
根据极差分析可知，7种碳、氮源对菌丝生长影响的大小依次为B>C>D>G>A>E=F，即葡萄糖>D-果糖>玉米粉>蛋白胨>蔗糖>酵母粉=黄豆粉（表2）。最佳组合配方是A1B2C2D1E3F2G3：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黄豆粉0.8%，蛋白胨1%。
2.3 培养温度对菌丝体生物量的影响
图2的结果表明，红根菌菌丝体在低于25℃、高于31℃的培养环境下生长缓慢，最适生长温度为29℃，该温度下菌丝体生物量可达2.05 g/100mL。
2.4 菌种菌龄对菌丝体生物量的影响
6种菌龄的菌种经接种培养后，菌丝体生物量差异不显著，其中菌龄120 h的生物量略高于其他5个供试菌龄（图3）。
2.5 液体培养的菌丝体致病性验证结果 利用浸根接种法静置接种10 d后，在培养液表面形成块状菌丝体并开始蔓延，逐渐侵染至组培苗根部，组培苗叶片开始黄化、萎蔫、脱落（图4A）；静置接种20 d，三角瓶培养液表面形成一整块菌丝体，菌丝侵染组培苗根部形成白色的菌膜（图4C）。利用木屑菌棒接种法接种20 d后，菌丝长满玻璃瓶，组培苗叶片出现黄化、萎蔫和脱落的症状（图4B）；接种30 d后，菌丝体侵染整个根部和部分根茎部，形成白色菌膜（图4D）。
3 讨论
本研究在前文报道橡胶树红根病病菌生物学特性[5]、其它担子菌培养基[9-13]以及前期实验基础上，选择适合橡胶树红根病病菌液体培养的碳氮源。通过正交试验极差分析，3种碳源中葡萄糖对菌丝生长影响最大，D-果糖和蔗糖次之；4种氮源中玉米粉对菌丝生长影响最大，随后依次是蛋白胨、酵母粉、黄豆粉。碳源的利用效率与前文报道略有不同，可能是固定培养基静置培养与液体培养基转动培养这2种培养方式的差异所致。最后综合得出了适合橡胶树红根病病菌液体培养的配方是：蔗糖1%，葡萄糖2%，D-果糖2%，玉米粉0.5%，酵母粉0.5%，黄豆粉0.8%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，VB1 0.02%。本研究还对培养周期、培养温度和菌种菌龄等几个重要培养因素进行了单因素筛选，结果得出最适生长温度为29℃，低于25℃、高于31℃菌丝生长缓慢；菌种菌龄对菌丝体生物量影响不显著，其中菌龄120 h的菌丝体生物量达到最大值。由此确定最适合红根病病菌液体培养的条件为：液体菌种菌龄120 h，培养温度29℃，培养周期240 h。在以上培养基和培养条件下，红根病病菌菌丝体生物量最大可达2.11 g/（100 mL），远高于固体培养所得到的菌丝体生物量。试验表明，液体培养的菌丝体仍然具有较强的侵染力，橡胶灵芝液体培养的成功有利于红根病接种鉴定方法的改良及橡胶树红根病抗性鉴定评价体系的建立。同时，橡胶灵芝在现有的培养条件下，生长速度较其他灵芝菌[14-15]缓慢。因此，后续的研究仍需要在现有的培养基基础上，优化相关的微量元素及营养元素含量，进一步提高橡胶灵芝液体培养效果。
参考文献
[1] Nandris D， Nicole M， Geiger J P. Root rot diseases of rubber trees[J]. Plant Disease， 1987， 71（4）： 298-306.
[2] 丁雄飞，刘昌芬. 云南橡胶树灵芝分类研究[J]. 云南热作科技，1995，18（2）： 14-19.
[3] 何 康，黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州： 广东科技出版社，1987：294-300.
[4] 张运强，张辉强. 橡胶树红根病的蔓延速度及预测预报[J]. 热带作物学报，1998，19（1）：7-12.
[5] 张 贺，蒲金基，张 欣，等. 橡胶树红根病病原菌生物学培养特性[J]. 热带作物学报，2008，29（5）：632-635.
[6] 张运强，张辉强，邓晓东. 橡胶树红根病病原菌的鉴定[J]. 热带作物学报，1997，18（1）：16-23.
[7] 白建相，王 涓，黄 林，等. 云南河口垦区橡胶树根病普查及治理方法探讨[J]. 热带农业科技， 2008， 31（3）： 7-11.
[8] 高秀兵，李增平，李晓娜，等. 橡胶树几种根病的人工接种方法[J]. 热带作物学报，2010，31（4）：626-630.
[9] 任海霞，杨 鹏，曲 玲，等. 草菇液体菌种培养条件优化研究[J]. 山东农业科学，2014，46（1）：58-60.
[10] 王治江，高红中，王少秋，等. 杏鲍菇液体培养胞外酶活性研究[J]. 蔬菜，2014，（3）：69-71.
[11] 董玉兰，李书生，张丽萍，等. 白灵菇高活力液体菌种摇瓶发酵培养条件的优化[J]. 北方园艺，2014（6）：143-146.
[12] 王 红，郭成金. 正交设计法香菇菌丝体液体培养基的筛选[J]. 中国酿造，2013，32（4）：74-77.
[13] 肇 莹，肖 军，王 娜，等. 蓝莓菌根真菌液体培养条件的正交试验优化[J]. 湖北农业科学，2013，52（10）：2 268-2 269.
[14] 马 凤，刘 波，张跃新，等. 松杉灵芝液体培养条件优化试验[J]. 防护林科技，2013（12）：34-35.
[15] 夏 险，刘健勇，涂俊铭. 血芝深层液体培养研究初探[J]. 食用菌，2012（6）：11-12.