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摘要
以pJawoh18RNAi载体为骨架，构建地塞米松诱导的二元载体pElrLEG。通过在pElrLEG载体上的XhoI与SpeI位点插入2个同向的locus of Xover P1（Loxp）位点，以及在Loxp位点之间再插入Glucocorticoid Recepot（GR）融合的Cre重组酶及Gateway cassette，从而成功构建地塞米松诱导型二元载体。
关键词pJawoh18RNAi；Loxp；糖皮质激素受体；Cre
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）25-031-03
AbstractUse pJawoh18RNAi as the backbone to construct a GR induced binary vector （pElrLEG）. In order to construce the PElrLEG Vetor， two locus of Xover P1（loxp） sites which have the same direction was cloned to the pElrLEG by XhoI and SpeI sites， GR fused Crerecombination enzyme and a Gateway cassette were cloned between the two loxp sites.
Key wordspJawoh18RNAi； Loxp； GR； Cre
常见的诱导型载体有四环素类、糖皮质激素类、雌激素类、酒精类、蜕皮（Ecdysone）激素类、金属类。这些类型的诱导载体各有优劣。四环素诱导型载体，其四环素使用量大，不仅对细胞产生毒害，而且对环境也会造成危害；雌激素诱导型载体，由于雌激素在植物体内不易扩散，局部诱导性强，因此不适宜对整株植物诱导；蜕皮激素诱导型载体，其缺点是叶片对蜕皮激素吸收差；酒精诱导型载体，其缺点：酒精对植物有毒害作用，且易挥发；铜诱导型载体，诱导素元铜对细胞有毒害作用，且其扩散有限；地塞米松是糖皮质激素诱导型表达载体的诱导剂，不仅无毒，而且可以高效地被运输到植物的各个组织。
正因为地塞米松具有以上优点，所以糖皮质激素诱导型表达载体适合用于植物转基因。目前研究大部分都是将GRCre重组酶片段和Loxp位点分别构建在2个Ti质粒的TDNA上，要实现Loxp位点的重组，
必须将2个质粒的转基因植株进行杂交，如果将GRCre重组酶片段和Loxp位点同时构建在同一个载体上，那么Loxp位点的重组无需通过杂交，这样既可以节省时间也可以减少工作量[1-3]。
由于重组酶能使Loxp位点的DNA发生重组，而DNA位于细胞核内，因此，Gre只能在细胞核内起作用。Cre与GR的融合蛋白，在不外加地塞米松时，GRCre通过GR结合在内质网上，DNA重组不能发生；当有地塞米松时，GRCre通过GR与地塞米松结合，使得GRCre从内质网上脱落，进入细胞核内，结合到Loxp位点上，引发重组[4-5]。在Loxp位点之间还含有一个Gateway cassette和多克隆位点（MCS），Gateway克隆技术的优点是不受酶切位点的限制，该载体的Gateway cassette含有attR1和attR2两个重组位点，这个位点用于克隆不同的启动子，而多克隆位点（MCS）位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克隆[6]。位于loxP位点之间的DNA，将在外加地塞米松的情况下，引发DNA重组而被敲除[7-11]。
1材料与方法
1.1材料
试验所用菌株是DH5α与DB3.1，DB3.1用于进行克隆或者扩繁含有Gateway片段的质粒[6]。质粒是pJawoh18RNAi、pCre、pUC57。限制性内切酶及T4 DNA连接酶均购自于NEB公司。PCR引物由primer5设计，PrimerSTAR TM HS Polymerase购自于TaKaRa公司。
1.2方法
PCR反应体系：模板DNA 0.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）各1 μl，10×buffer 5 μl， dNTPs（10 mmol/μl）5 μl，DNA聚合酶0.5 U，加水补齐50 μl。酶切体系：DNA 1 μg，buffer 2 μl，内切酶各加1 U，加水补齐20 μl，37 ℃酶切过夜，连接体系：载体：目的片段为1∶3～1∶9，T4连接酶1 U，buffer 2 μl，加水补齐20 μl，4 ℃连接过夜。
2结果与分析
2.1LoxpnosLoxp（XhoISofILoxpNheINcoINOSBsiwIKpnIStuIBgIIIMfeIAatII1xMycLoxpSpeI）片段的合成
LoxpnosLoxp（南京金斯瑞生物科技公司合成）是以XhoI及SpeI位点克隆在pUC57载体上。该片段含有2个同向Loxp位点，NOS终止信号序列位于NcoI与BsiwI位点之间。Myc标签用于蛋白表达检测，多克隆位点用于克隆基因（图1）。
2.2工程质粒的构建
以pJawoh18RNAi二元载体为骨
3讨论
Cre是从噬菌体P1分离出来的DNA特异位点重组酶。Loxp位点是Cre识别位点，其最早也是在P1噬菌体中被发现。loxP在两端有13个反向重复的碱基，中间核心序列是8个非回文结构的碱基，共34个碱基。Cre重组酶识别并结合在loxP位点的两端，并从中间核心序列区将loxP切开。2个同向的loxP位点，在重组酶的作用下将2个loxP切开从而产生4个黏性末端，loxP位点之间的序列会自我连接成环，从而从基因组中环出丢失。 pElrLCG该载体的优点：①地塞米松作为诱导化学物质对植物无毒害作用，而且可以高效地被运输到植物的各个组。②该载体可以同时使用Gateway克隆技术以及常规酶切连接克隆技术。③GRCre重组酶表达后，可以通过是否施加地塞米松来控制Cre的入核，从而人为控制何时把转入的基因从基因组中删除掉。④该载体在杂交育种中也有很大潜力，如花粉不育的性状优良的母本，利用含有目的基因的载体即可得到花粉可育（转基因）和花粉不育（转入的目的基因环出丢失）的植株，这样花粉可育的植株可以用来繁殖种子，而花粉不育的植株可以用作杂交育种的母本。⑤该载体的Myc标签可以用于检测转入的基因是否表达。⑥该载体在施加地塞米松诱导后，GRCre进入核引发Loxp位点重组，Loxp位点之间的DNA片段从基因组里环出，由于环出的DNA片段包含了GRCre以及转入的基因，而又不含有启动子与3′末端加尾信号。因此，只要Loxp位点重组发生，GRCre及目的基因的转录即终止。总之，该载体在实现转基因，可以选择性地关闭/删除目的基因。
参考文献
[1] VIVI K，MAKOTO M，KAZUNARI T.Control of siRNA expression using the CreloxPrecombination system[J].Nucleic acids research，2004，32（7）：66-66.
[2] VAN DUYNE G D.A structural view of creloxP sitespecific recombination[J].Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，2001，30：87-104.
[3] SHAIKH A C，SADOWSKI P D J.The Cre Recombinase Cleaves the lox site intrans[J].Biol Chem，1997，272（9）：5695-5702.
[4] WALDEN R，FRITZE K，HAYASHI H，et al.Activation tagging：a means of isolating genes implicated as playing a role in plant growth and development[J].J Plant Mol Biol，1994，26：1521-1528.
[5] KACZMARCZYK S J，GREEN J E.A single vector containing modified crerecombinase and LOX recombination sequences for inducible tissuespecific amplification of gene expression[J].Nucl.Acids Res，2001，29（12）：56.
[6] CURTIS M D，GROSSNIKLAUS U A.Gateway cloning vector set for highthroughput functional analysis of genes in plant[J].Plant Physiol，2003，103（2）：462-469.
[7] JASINSKIENE N，COATES C J，ASHIKYAN A，et al.High efficiency，sitespecific excision of a marker gene by the phage P1 creloxP system in the yellow fever mosquito，Aedes aegypti[J]. Nucl Acids Res，2003，31（22）：147.
[8] JULLIEN N，SAMPIERI F，ENJALBERT A，et al.Regulation of Cre recombinase by ligandinduced complementation of inactive fragments[J].Nucl Acids Res，2003，31（21）：131.
[9] LAUTH M，SPREAFICO F，DETHLEFFSEN K，et al.Stable and efficient cassette exchange under nonselectable conditions by combined use of two sitespecific recombinases[J].Nucl acids res，2002，30（21）：115.
[10] OW D W.Recombinasedirected plant transformation for thepostgenomic era[J].Plant molecular biology，2002，48：183-200.
[11] RAMACHANDRAN S，HIRATSUKA K，CHUA N H.Transcription factors in plant growth and development[J].Curr Opin Genet Dev，1994，4（5）：642-646.
[12] POGORELKO G V，FURSOVA O V，OGARKOVA O A，et al.New vector system for induction of gene expression in dicotyledonous plants[J].Russian journal of genetics，2007，43（2）：194-201.
[13] POGORELKO G V，FURSOVA O V，OGARKOVA O A，et al.A new technique for activation tagging in Arabidopsis[J].Gene，2008，414（1/2）：67-75.
以pJawoh18RNAi载体为骨架，构建地塞米松诱导的二元载体pElrLEG。通过在pElrLEG载体上的XhoI与SpeI位点插入2个同向的locus of Xover P1（Loxp）位点，以及在Loxp位点之间再插入Glucocorticoid Recepot（GR）融合的Cre重组酶及Gateway cassette，从而成功构建地塞米松诱导型二元载体。
关键词pJawoh18RNAi；Loxp；糖皮质激素受体；Cre
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）25-031-03
AbstractUse pJawoh18RNAi as the backbone to construct a GR induced binary vector （pElrLEG）. In order to construce the PElrLEG Vetor， two locus of Xover P1（loxp） sites which have the same direction was cloned to the pElrLEG by XhoI and SpeI sites， GR fused Crerecombination enzyme and a Gateway cassette were cloned between the two loxp sites.
Key wordspJawoh18RNAi； Loxp； GR； Cre
常见的诱导型载体有四环素类、糖皮质激素类、雌激素类、酒精类、蜕皮（Ecdysone）激素类、金属类。这些类型的诱导载体各有优劣。四环素诱导型载体，其四环素使用量大，不仅对细胞产生毒害，而且对环境也会造成危害；雌激素诱导型载体，由于雌激素在植物体内不易扩散，局部诱导性强，因此不适宜对整株植物诱导；蜕皮激素诱导型载体，其缺点是叶片对蜕皮激素吸收差；酒精诱导型载体，其缺点：酒精对植物有毒害作用，且易挥发；铜诱导型载体，诱导素元铜对细胞有毒害作用，且其扩散有限；地塞米松是糖皮质激素诱导型表达载体的诱导剂，不仅无毒，而且可以高效地被运输到植物的各个组织。
正因为地塞米松具有以上优点，所以糖皮质激素诱导型表达载体适合用于植物转基因。目前研究大部分都是将GRCre重组酶片段和Loxp位点分别构建在2个Ti质粒的TDNA上，要实现Loxp位点的重组，
必须将2个质粒的转基因植株进行杂交，如果将GRCre重组酶片段和Loxp位点同时构建在同一个载体上，那么Loxp位点的重组无需通过杂交，这样既可以节省时间也可以减少工作量[1-3]。
由于重组酶能使Loxp位点的DNA发生重组，而DNA位于细胞核内，因此，Gre只能在细胞核内起作用。Cre与GR的融合蛋白，在不外加地塞米松时，GRCre通过GR结合在内质网上，DNA重组不能发生；当有地塞米松时，GRCre通过GR与地塞米松结合，使得GRCre从内质网上脱落，进入细胞核内，结合到Loxp位点上，引发重组[4-5]。在Loxp位点之间还含有一个Gateway cassette和多克隆位点（MCS），Gateway克隆技术的优点是不受酶切位点的限制，该载体的Gateway cassette含有attR1和attR2两个重组位点，这个位点用于克隆不同的启动子，而多克隆位点（MCS）位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克隆[6]。位于loxP位点之间的DNA，将在外加地塞米松的情况下，引发DNA重组而被敲除[7-11]。
1材料与方法
1.1材料
试验所用菌株是DH5α与DB3.1，DB3.1用于进行克隆或者扩繁含有Gateway片段的质粒[6]。质粒是pJawoh18RNAi、pCre、pUC57。限制性内切酶及T4 DNA连接酶均购自于NEB公司。PCR引物由primer5设计，PrimerSTAR TM HS Polymerase购自于TaKaRa公司。
1.2方法
PCR反应体系：模板DNA 0.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）各1 μl，10×buffer 5 μl， dNTPs（10 mmol/μl）5 μl，DNA聚合酶0.5 U，加水补齐50 μl。酶切体系：DNA 1 μg，buffer 2 μl，内切酶各加1 U，加水补齐20 μl，37 ℃酶切过夜，连接体系：载体：目的片段为1∶3～1∶9，T4连接酶1 U，buffer 2 μl，加水补齐20 μl，4 ℃连接过夜。
2结果与分析
2.1LoxpnosLoxp（XhoISofILoxpNheINcoINOSBsiwIKpnIStuIBgIIIMfeIAatII1xMycLoxpSpeI）片段的合成
LoxpnosLoxp（南京金斯瑞生物科技公司合成）是以XhoI及SpeI位点克隆在pUC57载体上。该片段含有2个同向Loxp位点，NOS终止信号序列位于NcoI与BsiwI位点之间。Myc标签用于蛋白表达检测，多克隆位点用于克隆基因（图1）。
2.2工程质粒的构建
以pJawoh18RNAi二元载体为骨
3讨论
Cre是从噬菌体P1分离出来的DNA特异位点重组酶。Loxp位点是Cre识别位点，其最早也是在P1噬菌体中被发现。loxP在两端有13个反向重复的碱基，中间核心序列是8个非回文结构的碱基，共34个碱基。Cre重组酶识别并结合在loxP位点的两端，并从中间核心序列区将loxP切开。2个同向的loxP位点，在重组酶的作用下将2个loxP切开从而产生4个黏性末端，loxP位点之间的序列会自我连接成环，从而从基因组中环出丢失。 pElrLCG该载体的优点：①地塞米松作为诱导化学物质对植物无毒害作用，而且可以高效地被运输到植物的各个组。②该载体可以同时使用Gateway克隆技术以及常规酶切连接克隆技术。③GRCre重组酶表达后，可以通过是否施加地塞米松来控制Cre的入核，从而人为控制何时把转入的基因从基因组中删除掉。④该载体在杂交育种中也有很大潜力，如花粉不育的性状优良的母本，利用含有目的基因的载体即可得到花粉可育（转基因）和花粉不育（转入的目的基因环出丢失）的植株，这样花粉可育的植株可以用来繁殖种子，而花粉不育的植株可以用作杂交育种的母本。⑤该载体的Myc标签可以用于检测转入的基因是否表达。⑥该载体在施加地塞米松诱导后，GRCre进入核引发Loxp位点重组，Loxp位点之间的DNA片段从基因组里环出，由于环出的DNA片段包含了GRCre以及转入的基因，而又不含有启动子与3′末端加尾信号。因此，只要Loxp位点重组发生，GRCre及目的基因的转录即终止。总之，该载体在实现转基因，可以选择性地关闭/删除目的基因。
参考文献
[1] VIVI K，MAKOTO M，KAZUNARI T.Control of siRNA expression using the CreloxPrecombination system[J].Nucleic acids research，2004，32（7）：66-66.
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[3] SHAIKH A C，SADOWSKI P D J.The Cre Recombinase Cleaves the lox site intrans[J].Biol Chem，1997，272（9）：5695-5702.
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[5] KACZMARCZYK S J，GREEN J E.A single vector containing modified crerecombinase and LOX recombination sequences for inducible tissuespecific amplification of gene expression[J].Nucl.Acids Res，2001，29（12）：56.
[6] CURTIS M D，GROSSNIKLAUS U A.Gateway cloning vector set for highthroughput functional analysis of genes in plant[J].Plant Physiol，2003，103（2）：462-469.
[7] JASINSKIENE N，COATES C J，ASHIKYAN A，et al.High efficiency，sitespecific excision of a marker gene by the phage P1 creloxP system in the yellow fever mosquito，Aedes aegypti[J]. Nucl Acids Res，2003，31（22）：147.
[8] JULLIEN N，SAMPIERI F，ENJALBERT A，et al.Regulation of Cre recombinase by ligandinduced complementation of inactive fragments[J].Nucl Acids Res，2003，31（21）：131.
[9] LAUTH M，SPREAFICO F，DETHLEFFSEN K，et al.Stable and efficient cassette exchange under nonselectable conditions by combined use of two sitespecific recombinases[J].Nucl acids res，2002，30（21）：115.
[10] OW D W.Recombinasedirected plant transformation for thepostgenomic era[J].Plant molecular biology，2002，48：183-200.
[11] RAMACHANDRAN S，HIRATSUKA K，CHUA N H.Transcription factors in plant growth and development[J].Curr Opin Genet Dev，1994，4（5）：642-646.
[12] POGORELKO G V，FURSOVA O V，OGARKOVA O A，et al.New vector system for induction of gene expression in dicotyledonous plants[J].Russian journal of genetics，2007，43（2）：194-201.
[13] POGORELKO G V，FURSOVA O V，OGARKOVA O A，et al.A new technique for activation tagging in Arabidopsis[J].Gene，2008，414（1/2）：67-75.