【摘 要】
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目的 观察Smad3对胰腺癌细胞Panc-1、BxPC-3凋亡、自噬的影响，初步探讨Smad3表达水平影响胰腺癌进程的可能机制。方法 基于GEPIA2数据库进行生物信息学分析，探究Smad3与胰腺癌发生、发展及生存的相关性。利用CRISPR/Cas9系统以及短发卡RNA（ShRNA）敲除及敲减Smad3的表达，采用Real-Time quantitative PCR（qPCR）和Western b
【机 构】
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西安医学院临床医学院中尼友好拉吉姆医学实验室
【基金项目】
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陕西省高校科协青年托举计划项目（20200314）； 陕西省科技厅面上项目（2021JM-495）； 国家自然科学基金国际合作交流项目（81550110256）～～；
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目的 观察Smad3对胰腺癌细胞Panc-1、BxPC-3凋亡、自噬的影响，初步探讨Smad3表达水平影响胰腺癌进程的可能机制。方法 基于GEPIA2数据库进行生物信息学分析，探究Smad3与胰腺癌发生、发展及生存的相关性。利用CRISPR/Cas9系统以及短发卡RNA（ShRNA）敲除及敲减Smad3的表达，采用Real-Time quantitative PCR（qPCR）和Western blot检测细胞中Smad3 mRNA和蛋白水平变化。实验组转入ShSmad3-1、ShSmad3-2序列，将不靶向任何基因的Sh-Scramble序列作为对照组（Scr）。将转入Smad3 guide RNA（gRNA）序列作为CRISPR/Cas9的实验组，转入空载质粒的作为CRISPR/Cas9的对照组。采用Western blot检测细胞中LC3、p62、p38以及p-p38蛋白变化情况，同时在敲减Smad3的胰腺癌细胞用PI-Annexin V试剂盒染色并进行流式分析。利用pLVX-Smad3质粒进行回补实验，并用p38抑制剂SB203580处理细胞检测相关蛋白的变化情况。结果 GEPIA2数据库及临床标本分析结果显示，Smad3在胰腺癌组织中高表达（P＜0.05）。在胰腺癌细胞BxPC-3中转入ShSmad3-1、ShSmad3-2后，Smad3的mRNA和蛋白水平均显著降低（P＜0.05）。同时在Panc-1中转入Smad3 guide RNA筛选到2个Smad3敲除细胞系。与对照组相比，敲减Smad3胰腺癌细胞凋亡显著增加（P＜0.05）。Western blot实验发现：Smad3敲减及敲除后，p-p38的蛋白水平显著增加（P＜0.05）,LC3、p62水平显著降低（P＜0.05）。进一步通过回补实验及利用SB203580处理胰腺癌细胞，发现p62、LC3蛋白水平能回复（P＜0.01）。结论 干扰Smad3促进胰腺癌细胞过度自噬，进而导致细胞凋亡增加，可能与激活p38/MAPK信号通路有关。
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