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摘 要：牡丹红斑病是危害牡丹的最重要病害之一。本研究欲通过对病原菌进行鉴定并明确其分类地位。采用形态学方法结合分子标记法对牡丹红斑病病原进行鉴定，利用Mega5软件对枝孢霉属进行系统发育树分析。结果表明：该病致病菌为牡丹枝孢霉，序列与GenBank登录号为GQ395812.1的ITS序列同源性最高，同源性大于99%。聚类分析发现，枝孢霉属可分为7个聚类组，样品菌株与牡丹枝孢霉为一类。分子鉴定与形态学鉴定结果一致，该研究为牡丹红斑病的快速诊断与防治提供了依据，并为枝孢属的系统发育和分类鉴定提供了参考。
关键词：牡丹红斑病；枝孢霉；ITS序列分析；系统发育树
中图分类号：Q945.8 文献标志码：A 论文编号：2014-0024
Abstract： The red spot was one of the most important diseases which harms peony tree. The aim of the research was to clarify its taxonomic status by identifying the pathogen of tree peony leaf spot. In this study， the pathogen was identified based on morphology and molecular identification， the ITS phylogenetic trees of Cladosporium spp. was generated with the soft of Mega 5. The result suggested that the pathogen of tree peony leaf spot was Cladosporium paeoniae， and its sequences had the highest homology with GQ395812.1 in GenBank， whose homology was greater than 99%. Cluster analysis suggested that the Cladosporium spp. could be divided into 7 groups. Samples strains and Cladosporium paeoniae belonged to a class. The molecular identification and morphology identification researched the same results. This paper provided the reference for the rapid diagnosis and prevention of tree peony red spot disease， and the information for phylogenetic and taxonomic identification of Cladosporium spp..
Key words： Tree Peony Red Spot； Cladosporium； Analysis of ITS Sequence； Phylogenetic Tree
0 引言
牡丹红斑病又称牡丹叶霉病，是中国牡丹产区的重要病害之一。此病主要危害牡丹叶片，也侵染叶柄、嫩枝、花器[1]。近年来，牡丹红斑病在牡丹产区发生普遍，危害严重，常导致叶片早枯，严重影响植株的生长和花芽分化，是生产实际中急需解决的问题。
目前，对牡丹红斑病的研究主要为其发病规律、药剂防治试验、病原的形态和致病性鉴定等。然而传统形态学鉴定方法研究病原菌多样性存在工作量大、重复性差等缺点[2]。随着分子生物学的发展，人们开始利用分子标记方法来鉴定病原菌种类。该方法可用于真菌属、种水平的分类，其序列差异有助于相似种的鉴别[3]。ITS区（internal transcribed space）是介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域[4]，该区域进化速度较编码区快，在种内不同菌株间高度保守，通过与数据库中与同源序列进行比较来确定其种属关系[5-6]。国内外对该方法的采用主要集中在疫霉菌（Phytophthora）、锈菌（Puccinia）、炭疽菌（Colletotrichum）和镰刀菌（Fusarium）等，但是对枝孢霉的研究相对较少[7]。唐建辉等[8]根据通用引物ITS1和ITS4扩增出西瓜炭疽病菌的ITS区段，对炭疽属24个种进行聚类分析研究了炭疽属的系统发育。陈玉玺等[9]通过对分离到的镰刀菌菌株进行ITS序列测定，构建了相关菌株的ITS序列系统发育树。Gardes[10]以ITS片段为模板，合成了多种引物，其中ITS1-F对真菌有很高的特异性，ITS4-B对担子菌的特异性很高。Curtis等[11]通过对来自不同地区的番茄叶霉病菌ITS序列进行分析比较，鉴定了番茄叶霉病原并证明该病菌种内保守。本研究以传统的形态学特征为基础，对牡丹红斑病病原菌的rDNA-ITS序列进行分析和比对，进而从分子水平上明确牡丹红斑病的病原菌类型。以期加深前人对枝孢霉的研究，快速准确的检测牡丹红斑病，并为该病的防治和抗性品种选育研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究田间试验于2013年在山东农业大学牡丹种种质资源圃进行，室内试验在山东农业大学林学院花卉研究实验室进行。牡丹红斑病的病叶采自山东农业大学牡丹种种质资源圃发病严重的牡丹植株。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离和纯化 采用常规的组织分离法进行分离纯化，将明显带有牡丹红斑病病症的病叶用10%的次氯酸钠消毒后切去病健交界处组织分别接种到PDA培养基上25℃培养，待菌落长出后进行纯化[6]，一个月后保存于4℃冰箱中备用。 1.2.2 形态学鉴定 对分离后得到的菌落在25℃下进行恒温培养。对其培养特征和形态特征进行观察并记录，以确定其种属地位。培养特征主要包括菌落形状、生长速度、菌落表面特征、菌落边缘特征、菌落质地、颜色等。形态特征的观察在电子显微镜下进行，主要包括菌丝体大小、形状、表面特征及孢子大小、形状、类型、颜色等[11]。
1.2.3 致病性鉴定 将分离到的牡丹红斑病病原菌的分离物在PDA培养基培养，温度25℃，直至菌落产生分生孢子。用灭菌的蒸馏水配制孢子悬浮液，在牡丹种植基地取健康的牡丹幼叶，75%酒精消毒，无菌水冲洗后晾干备用。灭菌的培养基中，铺一层灭菌的滤纸，加入灭菌的去离子水和经处理的牡丹叶片，用配置好的孢子悬浮液进行针刺接种，同时设置接种无菌水作为对照。按照柯赫氏法则，将接种后发病的叶片重新分离纯化，看分离得到的菌物是否与接种菌株相一致[12]。
1.2.4 分子生物学鉴定 采用改良的CTAB法提取菌株的DNA，进行PCR扩增测序。PCR扩增采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。其中ITS1位于18S rDNA的末端，而ITS4位于28S rDNA的起始部位。PCR采用25 ?L反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5 ?L，菌株总DNA 2 ?L，引物ITS1和ITS4各2 ?L （10 ?mol/L），ddH2O 6.5 ?L。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 105 s，35个循环；补平72℃ 10 min，4℃ 5 min[13-14]。PCR扩增产物于的1%的琼脂糖凝胶上电泳，并在凝胶成像系统上检测并记录扩增产物在琼脂糖凝胶上的图谱。利用Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒回收DNA片段，回收产物送由上海桑尼生物科技有限公司测序。测序的结果与GenBank中查到Cladosporium属的23个种的序列进行同源性分析，利用Mega5软件中邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图。
2 结果与分析
2.1 形态学鉴定
病株在PDA培养基上分离纯化后，形成墨绿色霉层，菌丝较短，生长比较缓慢，菌落背面星裂状。显微镜下观察病原菌，分生孢子大部分为椭圆形，大小不一，顶生，形成孢子链，分生孢子梗3～7根簇生，2～6个分隔。对照陆家云和张中义方法[15-16]，鉴定该病原菌为牡丹枝孢霉。
2.2 致病性鉴定
将孢子悬浮液进行针刺接种7天后，可发现牡丹枝孢霉对接种的品种均具有致病性，而对照组没有发病。发病叶片出现红褐色斑点，然后病斑慢慢扩大，颜色加深，变为紫褐色，后期出现墨绿色霉层。将接种后发病叶片的病斑进行分离培养，得到的菌株与接种的菌株形态与生理特性一致。
2.3 分子生物学鉴定
2.3.1 扩增结果分析 利用改良的CTAB法可以得到菌株的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，DNA的质量符合实验要求。以得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到长度约为580 bp左右的DNA片段，结果如图1所示。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒将胶进行回收测序的结果与GenBank中查到与牡丹枝孢霉登录号为GQ395812.1的ITS序列同源性最高，同源性大于99%。根据认证，真菌ITS区域比对，序列相似性大于99%，鉴别为同种[17]，鉴定该菌株为牡丹枝孢霉。
2.3.2 系统发育树分析 将测得的序列与在GenBank数据库中查到Cladosporium属的23个种，利用Mega5软件中邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图。如图2所示，可将枝孢霉属分为7个聚类组，样品与牡丹枝孢霉的同源性最高，聚为一组，此外与C.lignicola和C.delicatulum的亲缘关系相对较近。
3 讨论与结论
传统形态学鉴定病原真菌不仅工作量大、耗时长，并且结果准确性差。ITS序列分析可以准确地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，不仅解决了传统鉴定过程中的缺点，并为快速准确的鉴定植物病原提供了分子方面的依据。本研究通过对牡丹红斑病原的ITS序列分析，快速鉴定了牡丹红斑病的病原菌致病菌。通过致病菌株ITS的PCR扩增与序列测定，利用Mega5软件构建与GenBank中登录Cladosporium属的23个种的聚类分析树状图，表明该菌株与GenBank中登录的Cladosporium paeoniae之间高度同源，大于99%，同时与C. lignicola和C. delicatulum的亲缘关系相对较近。结果证明牡丹红斑病的致病菌为牡丹枝孢霉，与季延平等[1]的形态学鉴定结论相一致。由于国内外对枝孢霉的研究较少，本试验通过结合分子标记方法鉴定了牡丹红斑病的病原菌，并对其属内系统发育和分类状况做了探讨分析，对牡丹红斑病的快速诊断和抗病品种的选育具有一定意义，同时为牡丹枝孢霉的分类鉴定和系统发育等研究提供了一定的依据和资料。
参考文献
[1] 季延平，吴玉柱，刘殷，等. 牡丹红斑病发病规律的观察[J].中国森林病虫，2004，23（5）：6-10.
[2] 兰成忠，李本金，陈庆河，等.福建省致病疫霉菌SRAP遗传多样性分析[J].中国农学通报，2011，27（9）：395-399.
[3] 赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌分子检测中的应用[J].陕西农业科学，2004（4）：35-37.
[4] 李依韦，银玲. rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分类鉴定中的应用[J].内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，3（20）：17-20. [5] 马爱瑛. rDNA分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（32）：18079-18081.
[6] 白树猛，田黎. ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：52-53.
[7] 高永洋，高观朋，王倩倚，等.黄瓜黑星病菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].河南农业科学，2009（8）：78-83.
[8] 唐建辉，王伟.西瓜炭疽菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].安徽农业科学，2007，35（9）：2566-2568.
[9] 陈玉玺，张利平，吕志堂.株镰刀菌rDNA内转录间隔区ITS序列分析[J].安徽农业科学，2008，36（12）：4886-4887.
[10] Gardesm B. ITS primers with enhanced specificity for basid iomycetes-application to the identification of my corrhizae and rusts[J].Molecular Ecology， 1993，2（2）：115-120.
[11] Curtis M D， Gore J， Oliver R P. The phylogeny of the tomato leaf mould fungus Cladosporium syn，.Fulviafulva by analysis of rDNA sequences[J]. Curr Genet，1994，25：318-322.
[12] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[13] 方中达.植病研究方法（第三版）[M].北京：中国农业出版社，1998.
[14] 赵丹.牡丹根部茎部真菌病害及病原鉴定[D].洛阳：河南科技大学，2012.
[15] 段亚冰.牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究[D].洛阳：河南科技大学，2009.
[16] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.
[17] 张中义.中国真菌志[M].北京：科学出版社，2003.
关键词：牡丹红斑病；枝孢霉；ITS序列分析；系统发育树
中图分类号：Q945.8 文献标志码：A 论文编号：2014-0024
Abstract： The red spot was one of the most important diseases which harms peony tree. The aim of the research was to clarify its taxonomic status by identifying the pathogen of tree peony leaf spot. In this study， the pathogen was identified based on morphology and molecular identification， the ITS phylogenetic trees of Cladosporium spp. was generated with the soft of Mega 5. The result suggested that the pathogen of tree peony leaf spot was Cladosporium paeoniae， and its sequences had the highest homology with GQ395812.1 in GenBank， whose homology was greater than 99%. Cluster analysis suggested that the Cladosporium spp. could be divided into 7 groups. Samples strains and Cladosporium paeoniae belonged to a class. The molecular identification and morphology identification researched the same results. This paper provided the reference for the rapid diagnosis and prevention of tree peony red spot disease， and the information for phylogenetic and taxonomic identification of Cladosporium spp..
Key words： Tree Peony Red Spot； Cladosporium； Analysis of ITS Sequence； Phylogenetic Tree
0 引言
牡丹红斑病又称牡丹叶霉病，是中国牡丹产区的重要病害之一。此病主要危害牡丹叶片，也侵染叶柄、嫩枝、花器[1]。近年来，牡丹红斑病在牡丹产区发生普遍，危害严重，常导致叶片早枯，严重影响植株的生长和花芽分化，是生产实际中急需解决的问题。
目前，对牡丹红斑病的研究主要为其发病规律、药剂防治试验、病原的形态和致病性鉴定等。然而传统形态学鉴定方法研究病原菌多样性存在工作量大、重复性差等缺点[2]。随着分子生物学的发展，人们开始利用分子标记方法来鉴定病原菌种类。该方法可用于真菌属、种水平的分类，其序列差异有助于相似种的鉴别[3]。ITS区（internal transcribed space）是介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域[4]，该区域进化速度较编码区快，在种内不同菌株间高度保守，通过与数据库中与同源序列进行比较来确定其种属关系[5-6]。国内外对该方法的采用主要集中在疫霉菌（Phytophthora）、锈菌（Puccinia）、炭疽菌（Colletotrichum）和镰刀菌（Fusarium）等，但是对枝孢霉的研究相对较少[7]。唐建辉等[8]根据通用引物ITS1和ITS4扩增出西瓜炭疽病菌的ITS区段，对炭疽属24个种进行聚类分析研究了炭疽属的系统发育。陈玉玺等[9]通过对分离到的镰刀菌菌株进行ITS序列测定，构建了相关菌株的ITS序列系统发育树。Gardes[10]以ITS片段为模板，合成了多种引物，其中ITS1-F对真菌有很高的特异性，ITS4-B对担子菌的特异性很高。Curtis等[11]通过对来自不同地区的番茄叶霉病菌ITS序列进行分析比较，鉴定了番茄叶霉病原并证明该病菌种内保守。本研究以传统的形态学特征为基础，对牡丹红斑病病原菌的rDNA-ITS序列进行分析和比对，进而从分子水平上明确牡丹红斑病的病原菌类型。以期加深前人对枝孢霉的研究，快速准确的检测牡丹红斑病，并为该病的防治和抗性品种选育研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究田间试验于2013年在山东农业大学牡丹种种质资源圃进行，室内试验在山东农业大学林学院花卉研究实验室进行。牡丹红斑病的病叶采自山东农业大学牡丹种种质资源圃发病严重的牡丹植株。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离和纯化 采用常规的组织分离法进行分离纯化，将明显带有牡丹红斑病病症的病叶用10%的次氯酸钠消毒后切去病健交界处组织分别接种到PDA培养基上25℃培养，待菌落长出后进行纯化[6]，一个月后保存于4℃冰箱中备用。 1.2.2 形态学鉴定 对分离后得到的菌落在25℃下进行恒温培养。对其培养特征和形态特征进行观察并记录，以确定其种属地位。培养特征主要包括菌落形状、生长速度、菌落表面特征、菌落边缘特征、菌落质地、颜色等。形态特征的观察在电子显微镜下进行，主要包括菌丝体大小、形状、表面特征及孢子大小、形状、类型、颜色等[11]。
1.2.3 致病性鉴定 将分离到的牡丹红斑病病原菌的分离物在PDA培养基培养，温度25℃，直至菌落产生分生孢子。用灭菌的蒸馏水配制孢子悬浮液，在牡丹种植基地取健康的牡丹幼叶，75%酒精消毒，无菌水冲洗后晾干备用。灭菌的培养基中，铺一层灭菌的滤纸，加入灭菌的去离子水和经处理的牡丹叶片，用配置好的孢子悬浮液进行针刺接种，同时设置接种无菌水作为对照。按照柯赫氏法则，将接种后发病的叶片重新分离纯化，看分离得到的菌物是否与接种菌株相一致[12]。
1.2.4 分子生物学鉴定 采用改良的CTAB法提取菌株的DNA，进行PCR扩增测序。PCR扩增采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。其中ITS1位于18S rDNA的末端，而ITS4位于28S rDNA的起始部位。PCR采用25 ?L反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5 ?L，菌株总DNA 2 ?L，引物ITS1和ITS4各2 ?L （10 ?mol/L），ddH2O 6.5 ?L。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 105 s，35个循环；补平72℃ 10 min，4℃ 5 min[13-14]。PCR扩增产物于的1%的琼脂糖凝胶上电泳，并在凝胶成像系统上检测并记录扩增产物在琼脂糖凝胶上的图谱。利用Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒回收DNA片段，回收产物送由上海桑尼生物科技有限公司测序。测序的结果与GenBank中查到Cladosporium属的23个种的序列进行同源性分析，利用Mega5软件中邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图。
2 结果与分析
2.1 形态学鉴定
病株在PDA培养基上分离纯化后，形成墨绿色霉层，菌丝较短，生长比较缓慢，菌落背面星裂状。显微镜下观察病原菌，分生孢子大部分为椭圆形，大小不一，顶生，形成孢子链，分生孢子梗3～7根簇生，2～6个分隔。对照陆家云和张中义方法[15-16]，鉴定该病原菌为牡丹枝孢霉。
2.2 致病性鉴定
将孢子悬浮液进行针刺接种7天后，可发现牡丹枝孢霉对接种的品种均具有致病性，而对照组没有发病。发病叶片出现红褐色斑点，然后病斑慢慢扩大，颜色加深，变为紫褐色，后期出现墨绿色霉层。将接种后发病叶片的病斑进行分离培养，得到的菌株与接种的菌株形态与生理特性一致。
2.3 分子生物学鉴定
2.3.1 扩增结果分析 利用改良的CTAB法可以得到菌株的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，DNA的质量符合实验要求。以得到的DNA为模板，进行PCR扩增，得到长度约为580 bp左右的DNA片段，结果如图1所示。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒将胶进行回收测序的结果与GenBank中查到与牡丹枝孢霉登录号为GQ395812.1的ITS序列同源性最高，同源性大于99%。根据认证，真菌ITS区域比对，序列相似性大于99%，鉴别为同种[17]，鉴定该菌株为牡丹枝孢霉。
2.3.2 系统发育树分析 将测得的序列与在GenBank数据库中查到Cladosporium属的23个种，利用Mega5软件中邻接法（neighbor-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图。如图2所示，可将枝孢霉属分为7个聚类组，样品与牡丹枝孢霉的同源性最高，聚为一组，此外与C.lignicola和C.delicatulum的亲缘关系相对较近。
3 讨论与结论
传统形态学鉴定病原真菌不仅工作量大、耗时长，并且结果准确性差。ITS序列分析可以准确地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，不仅解决了传统鉴定过程中的缺点，并为快速准确的鉴定植物病原提供了分子方面的依据。本研究通过对牡丹红斑病原的ITS序列分析，快速鉴定了牡丹红斑病的病原菌致病菌。通过致病菌株ITS的PCR扩增与序列测定，利用Mega5软件构建与GenBank中登录Cladosporium属的23个种的聚类分析树状图，表明该菌株与GenBank中登录的Cladosporium paeoniae之间高度同源，大于99%，同时与C. lignicola和C. delicatulum的亲缘关系相对较近。结果证明牡丹红斑病的致病菌为牡丹枝孢霉，与季延平等[1]的形态学鉴定结论相一致。由于国内外对枝孢霉的研究较少，本试验通过结合分子标记方法鉴定了牡丹红斑病的病原菌，并对其属内系统发育和分类状况做了探讨分析，对牡丹红斑病的快速诊断和抗病品种的选育具有一定意义，同时为牡丹枝孢霉的分类鉴定和系统发育等研究提供了一定的依据和资料。
参考文献
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[6] 白树猛，田黎. ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：52-53.
[7] 高永洋，高观朋，王倩倚，等.黄瓜黑星病菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].河南农业科学，2009（8）：78-83.
[8] 唐建辉，王伟.西瓜炭疽菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析[J].安徽农业科学，2007，35（9）：2566-2568.
[9] 陈玉玺，张利平，吕志堂.株镰刀菌rDNA内转录间隔区ITS序列分析[J].安徽农业科学，2008，36（12）：4886-4887.
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[11] Curtis M D， Gore J， Oliver R P. The phylogeny of the tomato leaf mould fungus Cladosporium syn，.Fulviafulva by analysis of rDNA sequences[J]. Curr Genet，1994，25：318-322.
[12] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[13] 方中达.植病研究方法（第三版）[M].北京：中国农业出版社，1998.
[14] 赵丹.牡丹根部茎部真菌病害及病原鉴定[D].洛阳：河南科技大学，2012.
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[16] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京：中国农业出版社，2001.
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