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【摘要】 目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)BCR/ABL DCCF-FISH的信号特点及其与染色体核型的关系。结果 使用BCR/ABL的DCDF探针对65例慢性粒细胞白血病骨髓标本进行荧光原位杂交及染色体核型检查。结果 65例CML核型43例Ph阳性,1例阴性,其余21例未行核性检查或无可分析分裂相;FISH结果65例均为BCR/ABL阳性,其中9例伴ASS基因缺失,5例复杂易位,1例+Ph伴ASS基因缺失。结论 传统核型与DCDF-FISH,应互相结合,方可对遗传学特征作出更准确分析。
【关键词】 慢性粒细胞白血病; Ph染色体;DCDF-FISH;BCR/ABL
Significance of BCR/ABL DCDF-FISH signal pattern and karyotype in chronic myeloid leukemia
DU Qing-hua,YING Yi,CHEN Xiao-yan.Department of Hematology, the First People’s Hospital of Guangzhou,Guangdong 510180,China
【Abstract】 Objective To investigate the relation between the BCR/ABL DCDF-FISH signal pattern and karyotype in chronic myeloid leukemia(CML).Methods 65 cases of CML were performed FISH and karyotyping.Results In 65 cases CML.43 cases were Ph positive,1 case was Ph negative,21 cases had no performed karyotyping analysis.All of 65 cases were FISH positive,9 cases with ASS gene deletion,5 cases with complex variant translocation,1 case with(+)Ph and ASS gene deletion.Conclusion More precise analysis can be got by combining the result of FISH and karyotyping.
【Key words】 CML; Ph CHROMOSOME; DCDF-FISH; BCR/ABL
费城染色体(Ph)是慢性粒细胞白血病(CML)的遗传学特征。通过染色体核型分析,能观察到该染色体源于与9号染色体易位后的22号染色体。荧光原位杂交(FISH)的出现则使人们能从分子水平上检测该易位导致的BCR/ABL融合基因[1-3]。这些检测手段都为CML的发病、诊断及治疗提供了重要的依据。本研究通过使用DCDF探针对65例CML进行FISH检测,并且结合染色体核型进行分析及对比,结果如下。
1 材料与方法
1.1 临床资料 65例病例为2006~2009年来我院就诊CML患者,其中男50例,女15例,平均年龄44岁。诊断参照《血液学诊断及疗效标准》[4]。
1.2 试剂及仪器 仪器: ZEISS AXIOPLAN2荧光显微镜;标本采集: 取患者骨髓标本2 ml,以肝素抗凝。以终密度1×106/ml接种于10 ml 1640(含20%胎牛血清)中。培养24 h后加秋水仙碱(终浓度0.05μg/ml)作用30 min,用0.075M KCl低渗处理半小时,再以3:1甲醇、冰醋酸固定三次。固定后标本放-20℃保存待检。
1.3 细胞遗传学分析 核型以G显带技术分析20个分裂相,核型根据《人类细胞遗传学国际命名体制2005》(ISCN 2005)进行描述。
1.4 荧光原位杂交 FISH探针使用BCR/ABL DCDF探针(Vysis)。取固定后的标本滴于玻片上,气干后标记杂交区域,并于55℃温箱老化30 min。取1 μl探针2 μl去离子水及7 μl杂交缓冲液共10 μl混匀,滴加于杂交区,加盖玻片以树胶封固,然后置于杂交仪中,运行的杂交程序为75℃2 min,37℃16 h。去除盖玻片,以含0.1%NP40的0.4×SSC洗涤、晾干,然后加10 μlDAPI于杂交区并以盖玻片封片,在荧光显微镜下观察。蓝色(DAPI)作为衬染,染的是细胞核;红色(Red)是9q上的ABL基因;绿色(Green)是22q上的BCR基因;2红2绿互相分离为阴性,若红色信号与绿色信号相连甚至重叠则认为是融合信号。计数200个细胞,并记录其信号特征。
2 结果
2.1 核型及FISH的检出率 65例CML患者 FISH均为阳性,核型43例阳性,1例阴性,其余21例未行核性检查或无可分析分裂相,FISH检出率为100%,核型检出率为97%。
2.2 DCDF探针信号表现 1红1绿2融合(1R1G2F)31例,为典型阳性信号;1红2绿1融合(1R2G1F)5例,为BCR/ABL伴ASS基因缺失;2红2绿1融合(2R2G1F)5例,一般为复杂变异易位。
3 讨论
染色体核型分析是Ph的检测重要方法,但由于需要制备分裂中期的细胞,实验的成败取决于分裂相的数量与质量。FISH技术可对分裂中期及间期的细胞进行分析,因此其分析细胞数量多,且能更真实地反映标本中阳性细胞的比例。而且对于某些核型无法分辨的隐匿易位,FISH也能敏感地检出。
本实验43例Ph阳性,1例阴性,而其FISH检测结果均为阳性,可推测该1例Ph阴性患者 可能存在隐匿易位。
BCR/ABL DCDF探针中的abl探针自ASS基因的着丝粒端至ABL最后一个外显子,长650 kb,BCR探针自编码免疫球蛋白λ轻链区开始往端粒端延伸约1.5 Mb;BCR/ABL ES 探针中的abl探针与DCDF探针相同 ;BCR探针从M-bcr外显子2和3开始延伸超过m-bcr之外,总长300 kb。
结果中可见9例DCDF探针信号表现为1R2G1F。这种情况是由于t(9;22)中衍生9号染色体-der(9)上9q34片断ASS基因的缺失所致。DCDF探针原应在der(9)上形成融合信号,但由于9q34的缺失令红色信号的探针无法与der(9)结合,使der(9)仅剩绿色信号。由于缺失片段较小,核型无法反映该异常,故核型为单纯t(9;22)。该9例BCR/ABL阳性伴9q34缺失均为CML,占CML病例的14%,与王莉等报道16%[5]相当。
而表1中有5例信号表现为2R2G1F均为CML,该5例均为复杂变异易位。这种情况下,9号的abl的片断易位到22号染色体上,形成了一个融合信号。而22号上BCR片断并没有易位到9号上,而是易位到其他染色体上,所以造成原本der(9)上的融合信号分离(见图1图2)。本研究中约7%CML为复杂变异易位,略低于薛志科等报道的11%[6]。
特别的是表1中有1例DCDF-FISH信号表现为1R2G2F,其核型为47,XY,add(7)(p22),t(9;22)(q34;q11),+der(22)t(9;22)(q34;q11)。结合核型与FISH结果,由于增加了一条Ph染色体,融合信号应该增加一个,而DCDF探针仅比普通阳性增加一个绿色信号,是因为伴有9q34的缺失。
DCDF-FISH能检测ASS基因的缺失,而染色体核性因分辨率不足而不能发现该异常。染色体核性与DCDF探针均能提示复杂变异易位。但染色体核型能明确核型的异常,而FISH仅能提示与BCR/ABL相关的变化。综上所述,以上两者均有其特点及适用范围,不能相互替代。
参考文献
[1] Dewald GW,Wyatt WA,Juneau AL,et al.Highly sensitive fluorescence in situ hybridization method to detect double BCR/ABL fusion and monitor response to therapy in chronic myeloid leukemia.Blood,1998,91(9):3357-3365.
[2] Nacheva E,Holloway T,Brown K,Bloxham,D.,Green,A.R.,.Philadelphia-negative chronic myeloid leukemia:detection by FISH of BCR-ABL fusion gene localized either to chromosome 9 or chromosome 22.J.Br Haematol,1994,87(2):409-412.
[3] Haigh S,Cuthbert G.Fluorescence in situ hybridization characterization of different cryptic BCR-ABL rearrangements in chronic myeloid leukemia.Cancer Genet,Cytogenet.2004,155(2):132-137.
[4] 张之南.血液病诊断及疗效标准.科学出版社,2007:134-1386.
[5] 王莉,钱思轩,仇海荣,等.138例慢性髓系白血病衍生9号染色体缺失的研究.中国实验血液学杂志,2009,17(2):281-284.
[6] 薛志科,金洁,陈志妹,等.135例非单纯Ph染色体的慢性髓系白血病细胞遗传学分析.中国实验血液学杂志,2008,16(5):997-1001.
【关键词】 慢性粒细胞白血病; Ph染色体;DCDF-FISH;BCR/ABL
Significance of BCR/ABL DCDF-FISH signal pattern and karyotype in chronic myeloid leukemia
DU Qing-hua,YING Yi,CHEN Xiao-yan.Department of Hematology, the First People’s Hospital of Guangzhou,Guangdong 510180,China
【Abstract】 Objective To investigate the relation between the BCR/ABL DCDF-FISH signal pattern and karyotype in chronic myeloid leukemia(CML).Methods 65 cases of CML were performed FISH and karyotyping.Results In 65 cases CML.43 cases were Ph positive,1 case was Ph negative,21 cases had no performed karyotyping analysis.All of 65 cases were FISH positive,9 cases with ASS gene deletion,5 cases with complex variant translocation,1 case with(+)Ph and ASS gene deletion.Conclusion More precise analysis can be got by combining the result of FISH and karyotyping.
【Key words】 CML; Ph CHROMOSOME; DCDF-FISH; BCR/ABL
费城染色体(Ph)是慢性粒细胞白血病(CML)的遗传学特征。通过染色体核型分析,能观察到该染色体源于与9号染色体易位后的22号染色体。荧光原位杂交(FISH)的出现则使人们能从分子水平上检测该易位导致的BCR/ABL融合基因[1-3]。这些检测手段都为CML的发病、诊断及治疗提供了重要的依据。本研究通过使用DCDF探针对65例CML进行FISH检测,并且结合染色体核型进行分析及对比,结果如下。
1 材料与方法
1.1 临床资料 65例病例为2006~2009年来我院就诊CML患者,其中男50例,女15例,平均年龄44岁。诊断参照《血液学诊断及疗效标准》[4]。
1.2 试剂及仪器 仪器: ZEISS AXIOPLAN2荧光显微镜;标本采集: 取患者骨髓标本2 ml,以肝素抗凝。以终密度1×106/ml接种于10 ml 1640(含20%胎牛血清)中。培养24 h后加秋水仙碱(终浓度0.05μg/ml)作用30 min,用0.075M KCl低渗处理半小时,再以3:1甲醇、冰醋酸固定三次。固定后标本放-20℃保存待检。
1.3 细胞遗传学分析 核型以G显带技术分析20个分裂相,核型根据《人类细胞遗传学国际命名体制2005》(ISCN 2005)进行描述。
1.4 荧光原位杂交 FISH探针使用BCR/ABL DCDF探针(Vysis)。取固定后的标本滴于玻片上,气干后标记杂交区域,并于55℃温箱老化30 min。取1 μl探针2 μl去离子水及7 μl杂交缓冲液共10 μl混匀,滴加于杂交区,加盖玻片以树胶封固,然后置于杂交仪中,运行的杂交程序为75℃2 min,37℃16 h。去除盖玻片,以含0.1%NP40的0.4×SSC洗涤、晾干,然后加10 μlDAPI于杂交区并以盖玻片封片,在荧光显微镜下观察。蓝色(DAPI)作为衬染,染的是细胞核;红色(Red)是9q上的ABL基因;绿色(Green)是22q上的BCR基因;2红2绿互相分离为阴性,若红色信号与绿色信号相连甚至重叠则认为是融合信号。计数200个细胞,并记录其信号特征。
2 结果
2.1 核型及FISH的检出率 65例CML患者 FISH均为阳性,核型43例阳性,1例阴性,其余21例未行核性检查或无可分析分裂相,FISH检出率为100%,核型检出率为97%。
2.2 DCDF探针信号表现 1红1绿2融合(1R1G2F)31例,为典型阳性信号;1红2绿1融合(1R2G1F)5例,为BCR/ABL伴ASS基因缺失;2红2绿1融合(2R2G1F)5例,一般为复杂变异易位。
3 讨论
染色体核型分析是Ph的检测重要方法,但由于需要制备分裂中期的细胞,实验的成败取决于分裂相的数量与质量。FISH技术可对分裂中期及间期的细胞进行分析,因此其分析细胞数量多,且能更真实地反映标本中阳性细胞的比例。而且对于某些核型无法分辨的隐匿易位,FISH也能敏感地检出。
本实验43例Ph阳性,1例阴性,而其FISH检测结果均为阳性,可推测该1例Ph阴性患者 可能存在隐匿易位。
BCR/ABL DCDF探针中的abl探针自ASS基因的着丝粒端至ABL最后一个外显子,长650 kb,BCR探针自编码免疫球蛋白λ轻链区开始往端粒端延伸约1.5 Mb;BCR/ABL ES 探针中的abl探针与DCDF探针相同 ;BCR探针从M-bcr外显子2和3开始延伸超过m-bcr之外,总长300 kb。
结果中可见9例DCDF探针信号表现为1R2G1F。这种情况是由于t(9;22)中衍生9号染色体-der(9)上9q34片断ASS基因的缺失所致。DCDF探针原应在der(9)上形成融合信号,但由于9q34的缺失令红色信号的探针无法与der(9)结合,使der(9)仅剩绿色信号。由于缺失片段较小,核型无法反映该异常,故核型为单纯t(9;22)。该9例BCR/ABL阳性伴9q34缺失均为CML,占CML病例的14%,与王莉等报道16%[5]相当。
而表1中有5例信号表现为2R2G1F均为CML,该5例均为复杂变异易位。这种情况下,9号的abl的片断易位到22号染色体上,形成了一个融合信号。而22号上BCR片断并没有易位到9号上,而是易位到其他染色体上,所以造成原本der(9)上的融合信号分离(见图1图2)。本研究中约7%CML为复杂变异易位,略低于薛志科等报道的11%[6]。
特别的是表1中有1例DCDF-FISH信号表现为1R2G2F,其核型为47,XY,add(7)(p22),t(9;22)(q34;q11),+der(22)t(9;22)(q34;q11)。结合核型与FISH结果,由于增加了一条Ph染色体,融合信号应该增加一个,而DCDF探针仅比普通阳性增加一个绿色信号,是因为伴有9q34的缺失。
DCDF-FISH能检测ASS基因的缺失,而染色体核性因分辨率不足而不能发现该异常。染色体核性与DCDF探针均能提示复杂变异易位。但染色体核型能明确核型的异常,而FISH仅能提示与BCR/ABL相关的变化。综上所述,以上两者均有其特点及适用范围,不能相互替代。
参考文献
[1] Dewald GW,Wyatt WA,Juneau AL,et al.Highly sensitive fluorescence in situ hybridization method to detect double BCR/ABL fusion and monitor response to therapy in chronic myeloid leukemia.Blood,1998,91(9):3357-3365.
[2] Nacheva E,Holloway T,Brown K,Bloxham,D.,Green,A.R.,.Philadelphia-negative chronic myeloid leukemia:detection by FISH of BCR-ABL fusion gene localized either to chromosome 9 or chromosome 22.J.Br Haematol,1994,87(2):409-412.
[3] Haigh S,Cuthbert G.Fluorescence in situ hybridization characterization of different cryptic BCR-ABL rearrangements in chronic myeloid leukemia.Cancer Genet,Cytogenet.2004,155(2):132-137.
[4] 张之南.血液病诊断及疗效标准.科学出版社,2007:134-1386.
[5] 王莉,钱思轩,仇海荣,等.138例慢性髓系白血病衍生9号染色体缺失的研究.中国实验血液学杂志,2009,17(2):281-284.
[6] 薛志科,金洁,陈志妹,等.135例非单纯Ph染色体的慢性髓系白血病细胞遗传学分析.中国实验血液学杂志,2008,16(5):997-1001.