目的:建立土茯苓药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱及同时测定其中落新妇苷、白藜芦醇含量的方法。方法:采用HPLC法。色谱柱为Zorbax SB-C₁₈,流动相为甲醇-0.2%乙酸溶液（梯度洗脱）,流速为1.0 ml/min,检测波长为306 nm,柱温为30℃,进样量为20μl。以落新妇苷为参照物,对13批样品HPLC图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行相似度评价。结果:13批样品HPLC图谱有12个共有峰,相似度均>0.90。落新妇苷、白藜芦醇检测质量浓度线性范围分别为6.65⁴25.6、1.72¹10μg/ml（r均为0.999 9）;精密度、稳定性、重复性试验的RSD<3.0%;加样回收率分别为97.30%¹02.30%（RSD=1.97%,n=6）、98.12%¹04.02%（RSD=2.57%,n=6）。结论:该研究所建指纹图谱可为土茯苓药材的鉴别和质量评价提供参考;该测定方法操作简便,精密度、稳定性、重复性良好,可用于土茯苓药材中落新妇苷和白藜芦醇含量的同时测定。