研究微小RNA-135a (miR-135a) 对卵巢上皮性癌 (卵巢癌) 细胞系SKOV3细胞中HOXA10基因表达及细胞增殖和凋亡的影响。
方法(1) 应用生物信息学技术预测与miR-135a高度相关的靶基因 (即HOXA10基因) 。 (2) 将miR-135a成熟体模拟物 (mimics) 、miR-135a成熟体抑制物 (inhibitor) 及阴性对照分别转染SKOV3细胞,采用逆转录 (RT) -PCR技术和蛋白印迹法检测转染不同时间 (分别为24、48和72 h) 后SKOV3细胞中HOXA10 mRNA和蛋白的表达水平。 (3) 报告基因实验验证miR-135a对HOXA10基因表达的调节作用,采用含miR-135a的质粒和含HOXA10基因的重组质粒共同转染SKOV3细胞,以转染微小RNA (miRNA) 慢病毒质粒者为对照。 (4) 采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 比色法检测转染不同时间 (分别为24、48和72 h) 后SKOV3细胞的增殖能力[以吸光度 (A) 值表示],蛋白印迹法检测转染48 h后SKOV3细胞中凋亡相关蛋白[包括bcl-2、bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (caspase-3) ]的表达。
结果(1) 生物信息学技术预测,得出与miR-135a高度相关的靶基因为HOXA10基因。 (2) RT-PCR技术检测显示,随着转染时间的延长 (分别为24、48和72 h),miR-135a mimics转染后SKOV3细胞中HOXA10 mRNA的表达水平 (分别为0.94±0.04、0.78±0.03、0.70±0.03) 逐渐降低 (<italic>P</italic>< 0.05) ;miR-135a inhibitor转染后SKOV3细胞中HOXA10 mRNA的表达水平 (分别为1.14±0.05、1.16±0.03、2.60±0.08) 逐渐升高 (<italic>P</italic>< 0.05) ;且两者转染48及72 h后,分别与阴性对照 (为1.00) 比较,差异均有统计学意义 (<italic>P</italic><0.01) 。蛋白印迹法检测显示,转染不同时间后SKOV3细胞中HOXA10蛋白的表达水平与HOXA10 mRNA的变化一致。 (3) 报告基因实验显示,含miR-135a的质粒和含HOXA10基因的重组质粒共同转染SKOV3细胞后,与对照比较,其荧光素酶活性下降了67.8% (<italic>P</italic><0.01) 。 (4) MTT比色法检测显示,miR-135a mimics转染48和72 h后SKOV3细胞的增殖能力 (A值分别为0.38±0.03、0.67±0.05),明显低于阴性对照 (<italic>A</italic>值分别为0.52±0.05、0.75±0.06;<italic>P</italic><0.05) ;miR-135a inhibitor转染72 h后SKOV3细胞的增殖能力 (A值为0.95±0.05),明显高于阴性对照 (A值为0.75±0.06;<italic>P</italic><0.01) 。蛋白印迹法检测显示,miR-135a mimics转染后SKOV3细胞中bcl-2蛋白表达水平 (0.28±0.06) 明显低于阴性对照 (0.76±0.09;<italic>P</italic>< 0.01) ;bax蛋白表达水平无明显变化 (<italic>P</italic>=0.142) ; caspase-3酶活性 (115.0±2.4) 明显高于阴性对照 (95.4±2.1;<italic>P</italic><0.01) 。miR-135a inhibitor转染后SKOV3细胞中bcl-2蛋白表达水平 (0.92±0.03) 明显高于阴性对照 (0.76±0.09;<italic>P</italic>=0.037) ;bax蛋白表达水平无明显变化 (<italic>P</italic>=0.066) ;caspase-3酶活性 (59.5±4.1) 明显低于阴性对照 (95.4±2.1;<italic>P</italic><0.01) 。
结论miR-135a通过HOXA10基因及其下游通路中凋亡相关蛋白影响卵巢癌细胞的增殖和凋亡。