论文部分内容阅读
摘要：为研究农用多抗霉素对来自山东、安徽、河南的3株莱氏野村菌的抑菌效果。采用生长速率法测定多抗霉素对莱氏野村菌的EC50值，并通过EC50值进行抑菌效果对比。结果表明：多抗霉素对3株莱氏野村菌都有抑制效果，其中对来自山东的莱氏野村菌Nr13的抑制效果最佳，EC50值为0.437 7 mg/mL。
关键词：生物农药；莱氏野村菌；多抗霉素；生长速率法；抑菌效果；耐药性
中图分类号： S482.2 8文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0144-02
收稿日期：2014-08-30
基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2012]2101号）。
作者简介：龙亚飞（1987—），女，穿青族，贵州毕节人，硕士，主要从事发酵与制药的研究。E-mail：1067724485@qq.com。
通信作者：王啸，副教授，主要从事农药学的研究。E-mail：wangzi8903@126.com。长期、大量施用化学杀菌剂不仅会破坏生态环境，而且还会使病原菌产生抗药性，降低防治效果，因此关于生物防治的研究引起了人们的广泛关注[1-2]。多抗霉素是一种广谱抗生素，能干扰真菌细胞壁几丁质的生物合成[3]，从而抑制真菌生长；主要用于防治烟草赤星病、苹果斑点落叶病及番茄叶霉病等多种真菌病害。莱氏野村菌（Nomuraea rileyi，简称Nr）为昆虫的重要病原真菌[4]。在研究化学农药对虫生真菌菌丝生长、分生孢子萌发及分生孢子产生量时发现，虫生真菌与杀虫剂的相容性优于杀菌剂[5]。谭可欣用病原真菌菌块进行抑菌试验，结果表明，新多抗霉素对烟草赤星病菌、苹果斑点落叶病菌都具有很强的抑菌活性，其EC50值分别为0.39、0.43 mg/L[6]；奉代力等采用生长速率法测得10%多抗霉素B 可湿性粉剂对番茄灰霉病菌的EC50值为6.32 mg/L[7]；蒋婧婧通过对莱氏野村菌分生孢子的抑制性试验，筛选出2种药物对莱氏野村菌的最佳抑制浓度，其中潮霉素B的最佳抑制浓度为80 μg/mL，苯菌灵的最佳抑制浓度为2 μg/mL[8]。姜兴印采用孢子萌发法和生长速率法分别测定试验药剂对15个木霉菌株的抗性水平，求出每种药剂对不同木霉的毒力EC50值，通过EC50值比较不同木霉菌株对试验药剂的抗性程度[9]。
由于目前对莱氏野村菌耐农用抗生素多抗霉素的研究较少，因此本研究采用菌丝生长速率法研究农用多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的抑菌效果，筛选出耐多抗霉素的莱氏野村菌，这样多抗霉素可以杀死其他真菌而使莱氏野村菌不受影响，多抗霉素和莱氏野村菌孢子复配后施用可以实现同时杀菌杀虫的目的，从而减少化学农药的使用量，缓解化学防治对环境的压力。
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株由Nr13、Nr19、Nr41安徽农业大学虫生真菌菌种保藏库提供，由贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏，具体情况见表1。
表1供试菌株的寄主及来源
菌株代号寄主来源地Nr13菜粉蝶（Pieris rapae）山东平阴孝直Nr19小菜蛾（Plutella xylostella）安徽繁昌Nr41鳞翅目（Lepidoptera）幼虫河南南阳
1.2供试药剂
供试药剂为3%多抗霉素水剂（安徽省绩溪县农华生物科技有限公司）。
1.3供试培养基及菌株预培养
萨氏麦芽酵母膏（SMAY）培养基：40 g麦芽糖、10 g蛋白胨、20 g酵母膏、20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL。用含0.05%吐温-80的无菌水配制一定浓度的莱氏野村菌孢子菌悬液，将其涂布于SMAY培养基上，25 ℃下光照培养5～6 d，待菌落边缘长大量菌丝而没有产孢时，即可用于试验。
1.4方法
采用生长速率法测定抑菌效果[10-11]。根据3%多抗霉素在田间施用时的稀释剂量，将药剂配制成0.6、1.2、1.5、23 mg/mL等5个浓度梯度。在无菌条件下，用无菌水将多抗霉素分别稀释1.5、2.0、2.5、5.0、10.0倍。随后用移液枪吸取10 mL药液加入含90 mL冷却至50 ℃左右的SMAY培养基的三角瓶里，充分摇匀后迅速倒入4个灭菌培养皿（直径为 9 cm） 中，制成各系列浓度的含药SMAY培养基平板，以含等量无菌水的SMAY培养基平板为对照；待凝固后，用打孔器（直径5 mm）打取生长整齐一致的菌饼，菌丝面朝上接种于各含药培养基中央。25 ℃光照培养10 d，用十字交叉法测定各处理的菌落直径，3次重复，取平均数，计算相对抑制率。
抑制率=（A-C）-（B-C）A-C×100%。
式中：A表示对照菌落直径，mm；B表示原菌直径，mm；C表示处理菌落直径，mm。
1.5数据处理
用Excel对数据进行统计分析[12]，以试验中设定的浓度对数为横坐标（x），抑制率的概率为纵坐标（y），确定各药剂对病菌的毒力回归方程y=ax b、相关系数r以及有效抑制中浓度（EC50）。
2结果与分析
2.1供试多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的抑制作用
从表2可以看出，来自河南的莱氏野村菌Nr41对3%多抗霉素耐药性最强，在浓度为3 mg/mL时，抑菌率为673%；在浓度≤1.2 mg/mL时，抑制率低于50%。在浓度为 3 mg/mL 时，来自山东和安徽的莱氏野村菌Nr13和Nr19抑制率较高，分别为87.3%、88.5%，其中来自安徽的Nr19几乎没有生长。随处理浓度的降低，其对3株莱氏野村菌的抑制作用减弱。
2.2供试多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的毒力测试结果
表2多抗霉素对3株莱氏野村菌的抑制作用 处理浓度
（mg/mL）Nr13Nr19Nr41处理直
径（mm）抑菌率
（%）处理直
径（mm）抑菌率
（%）处理直
径（mm）抑菌率
（%）3.01.1587.3a0.8088.5a5.267.3a2.01.8579.6a1.2082.7b5.863.5a1.52.1576.2a1.5078.4b7.254.7a1.23.2064.6b2.7061.2b8.149.1a0.63.8557.5c3.2553.2c9.242.1a空白9.056.9515.9注：同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。
试验中采用生长速率法测定3%多抗霉素对不同地域的3株莱氏野村菌Nr13（山东）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）的抑菌活性，结果见表3，其中杀菌剂对病菌的EC50代表杀菌剂对病菌抑菌活性的高低[12]。由表3可知，来自河南的莱氏野村菌Nr41对3%多抗霉素的耐药性最强，其EC50值为 1054 0 mg/mL；其次是来自安徽的Nr19，其EC50值为 0.554 4 mg/mL；耐药性最弱的是来自山东的Nr13，其EC50值为0.437 7 mg/mL。表3多抗霉素对3株莱氏野村菌的耐药性
菌株菌株来源地毒力回归方程相关系数rEC50
（mg/mL）EC90
（mg/mL）Nr13山东平阴孝直y=0.443 9x 0.658 30.972 20.437 73.503 4Nr19安徽繁昌y=0.544 9x 0.639 60.951 90.554 43.005 3Nr41河南南阳y=0.384 0x 0.491 10.974 41.054 011.610 3
3结论与讨论
近年来，生防制剂作为有害生物综合治理（integrated pest management，简称IPM）的重要组成部分，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。丁子香酚、多抗霉素B、枯草芽孢杆菌和木霉菌均属于生物杀菌剂，对人畜安全，对自然环境安全、无污染，病原菌不易产生抗药性等[13-15]。本研究结果表明，3%多抗霉素对不同地域的莱氏野村菌Nr13（山东）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）都具有抑制活性。但3%多抗霉素对这3株莱氏野村菌的抑制效果均表现出一定的差异性，其中对来自河南的Nr41耐药性最佳，其EC50值为1.054 0 mg/mL，这对筛选具有耐药性的莱氏野村菌菌株具有一定的参考意义。本研究中多抗霉素对莱氏野村菌的EC50值为0.437 7～1.054 0 mg/mL。刘保友采用菌丝生长速率法测定苹果斑点落叶病菌对多抗霉素的敏感性，结果表明，多抗霉素对多数苹果斑点落叶病病菌的菌丝生长具有良好的抑制效果，EC50值为4.165 5～103.462 1 mg/mL[16]。奉代力等采用生长速率法测定10%多抗霉素B 可湿性粉剂对番茄灰霉病菌的EC50值为6.32 mg/L[7]。张亚等采用菌丝生长抑制法对烟草赤星病进行室内毒力测定，结果表明，3%多抗霉素对烟草赤星病的EC50值为0.383 5 mg/mL[17]。可见，多抗霉素对苹果斑点落叶病、番茄灰霉病和烟草赤星病的EC50值都小于其对莱氏野村菌的EC50值，因此，农用抗生素多抗霉素和莱氏野村菌孢子复配使用时，在一定浓度下，多抗霉素可以杀死其他真菌，而莱氏野村菌不受影响，这样杀虫毒力强[4]的莱氏野村菌可以寄生在害虫体内，至其死亡，实现同时杀菌杀虫的目的，从而减少化学农药的使用量，缓解化学防治对环境的压力；同时为控制江苏省烟草、番茄等农作物的主要害虫和真菌病害，促进生态农业发展提供必要的技术支撑。
参考文献：
[1]罗宽，王庄. 利用拮抗的Pseudomonas spp.和无致病力的P. solanacearum防治青枯病的研究[J]. 植物病理学报，1983，13（1）：51-56.
[2]Wilcox W F，Harman G E.Control of Phytophthora root rots of soybeans and raspberries with Trichoderma and Gliocladium spp.[J]. Petria，1991，1：140-144.
[3]宋宝安. 新杂环农药：杀菌剂卷[M]. 北京：化学工业出版社，2008：432.
[4]裘维蕃，余永年，卯晓岚，等. 菌物学大全[M]. 北京：科学出版社，1998：960-961.
[5]齐永霞. 白僵菌和绿僵菌在植物根际的定殖及对几种土传植物病原真菌的抑制作用研究[D]. 合肥：安徽农业大学，2011：49.
[6]谭可欣. 新多氧霉素的生产与应用研究[D]. 武汉：华中农业大学，2005：32-34.
[7]奉代力，王强，郑纪慈，等. 几种杀菌剂对番茄灰霉病菌的抑菌效果对比研究[J]. 浙江农业学报，2013，25（1）：119-123.
[8]蒋婧婧. 莱氏野村菌遗传转化体系的构建[D]. 合肥：安徽农业大学，2010：34-35.
[9]姜兴印. 抗药木霉菌高效生防菌株生物学及其制剂加工技术[D]. 泰安：山东农业大学，2006：17-68.
[10]孙广宇，宗兆锋. 植物病理学实验技术[M]. 北京：中国农业出版社，2002.
[11]NY/T1156.2—2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第2部分： 抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法[S].
[12]奉代力，王强，陈丽萍，等. 2种常见番茄致病真菌对几种杀菌剂的敏感性测定[J]. 中国农学通报，2013，29（16）：96-99.
[13]魏艳敏. 生物农药及其应用技术问答[M]. 北京：中国农业大学出版社，2007.
[14]高立起，孙阁. 生物农药集锦[M]. 北京：中国农业出版社，2009.
[15]胡永红，曹峥，杨文革，等. 多效霉素研究进展[J]. 江苏农业科学，2013，41（12）：1-4.
[16]刘保友，王英姿，张伟，等. 苹果斑点落叶病病菌对多抗霉素的抗药性及其地理分布[J]. 中国果树，2013（4）：49-51.
[17]张亚，何可佳，刘薇，等. 几种药剂防治烟草赤星病的药效试验[J]. 烟草科技，2009（10）：61-64.刘丽华，王双，关磊. 北乌头乙醇提取液对菜青虫体内保护酶活性的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：146-147.
关键词：生物农药；莱氏野村菌；多抗霉素；生长速率法；抑菌效果；耐药性
中图分类号： S482.2 8文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0144-02
收稿日期：2014-08-30
基金项目：贵州省科学技术基金（编号：黔科合J字[2012]2101号）。
作者简介：龙亚飞（1987—），女，穿青族，贵州毕节人，硕士，主要从事发酵与制药的研究。E-mail：1067724485@qq.com。
通信作者：王啸，副教授，主要从事农药学的研究。E-mail：wangzi8903@126.com。长期、大量施用化学杀菌剂不仅会破坏生态环境，而且还会使病原菌产生抗药性，降低防治效果，因此关于生物防治的研究引起了人们的广泛关注[1-2]。多抗霉素是一种广谱抗生素，能干扰真菌细胞壁几丁质的生物合成[3]，从而抑制真菌生长；主要用于防治烟草赤星病、苹果斑点落叶病及番茄叶霉病等多种真菌病害。莱氏野村菌（Nomuraea rileyi，简称Nr）为昆虫的重要病原真菌[4]。在研究化学农药对虫生真菌菌丝生长、分生孢子萌发及分生孢子产生量时发现，虫生真菌与杀虫剂的相容性优于杀菌剂[5]。谭可欣用病原真菌菌块进行抑菌试验，结果表明，新多抗霉素对烟草赤星病菌、苹果斑点落叶病菌都具有很强的抑菌活性，其EC50值分别为0.39、0.43 mg/L[6]；奉代力等采用生长速率法测得10%多抗霉素B 可湿性粉剂对番茄灰霉病菌的EC50值为6.32 mg/L[7]；蒋婧婧通过对莱氏野村菌分生孢子的抑制性试验，筛选出2种药物对莱氏野村菌的最佳抑制浓度，其中潮霉素B的最佳抑制浓度为80 μg/mL，苯菌灵的最佳抑制浓度为2 μg/mL[8]。姜兴印采用孢子萌发法和生长速率法分别测定试验药剂对15个木霉菌株的抗性水平，求出每种药剂对不同木霉的毒力EC50值，通过EC50值比较不同木霉菌株对试验药剂的抗性程度[9]。
由于目前对莱氏野村菌耐农用抗生素多抗霉素的研究较少，因此本研究采用菌丝生长速率法研究农用多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的抑菌效果，筛选出耐多抗霉素的莱氏野村菌，这样多抗霉素可以杀死其他真菌而使莱氏野村菌不受影响，多抗霉素和莱氏野村菌孢子复配后施用可以实现同时杀菌杀虫的目的，从而减少化学农药的使用量，缓解化学防治对环境的压力。
1材料与方法
1.1供试菌株
供试菌株由Nr13、Nr19、Nr41安徽农业大学虫生真菌菌种保藏库提供，由贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室保藏，具体情况见表1。
表1供试菌株的寄主及来源
菌株代号寄主来源地Nr13菜粉蝶（Pieris rapae）山东平阴孝直Nr19小菜蛾（Plutella xylostella）安徽繁昌Nr41鳞翅目（Lepidoptera）幼虫河南南阳
1.2供试药剂
供试药剂为3%多抗霉素水剂（安徽省绩溪县农华生物科技有限公司）。
1.3供试培养基及菌株预培养
萨氏麦芽酵母膏（SMAY）培养基：40 g麦芽糖、10 g蛋白胨、20 g酵母膏、20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL。用含0.05%吐温-80的无菌水配制一定浓度的莱氏野村菌孢子菌悬液，将其涂布于SMAY培养基上，25 ℃下光照培养5～6 d，待菌落边缘长大量菌丝而没有产孢时，即可用于试验。
1.4方法
采用生长速率法测定抑菌效果[10-11]。根据3%多抗霉素在田间施用时的稀释剂量，将药剂配制成0.6、1.2、1.5、23 mg/mL等5个浓度梯度。在无菌条件下，用无菌水将多抗霉素分别稀释1.5、2.0、2.5、5.0、10.0倍。随后用移液枪吸取10 mL药液加入含90 mL冷却至50 ℃左右的SMAY培养基的三角瓶里，充分摇匀后迅速倒入4个灭菌培养皿（直径为 9 cm） 中，制成各系列浓度的含药SMAY培养基平板，以含等量无菌水的SMAY培养基平板为对照；待凝固后，用打孔器（直径5 mm）打取生长整齐一致的菌饼，菌丝面朝上接种于各含药培养基中央。25 ℃光照培养10 d，用十字交叉法测定各处理的菌落直径，3次重复，取平均数，计算相对抑制率。
抑制率=（A-C）-（B-C）A-C×100%。
式中：A表示对照菌落直径，mm；B表示原菌直径，mm；C表示处理菌落直径，mm。
1.5数据处理
用Excel对数据进行统计分析[12]，以试验中设定的浓度对数为横坐标（x），抑制率的概率为纵坐标（y），确定各药剂对病菌的毒力回归方程y=ax b、相关系数r以及有效抑制中浓度（EC50）。
2结果与分析
2.1供试多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的抑制作用
从表2可以看出，来自河南的莱氏野村菌Nr41对3%多抗霉素耐药性最强，在浓度为3 mg/mL时，抑菌率为673%；在浓度≤1.2 mg/mL时，抑制率低于50%。在浓度为 3 mg/mL 时，来自山东和安徽的莱氏野村菌Nr13和Nr19抑制率较高，分别为87.3%、88.5%，其中来自安徽的Nr19几乎没有生长。随处理浓度的降低，其对3株莱氏野村菌的抑制作用减弱。
2.2供试多抗霉素对不同地域莱氏野村菌的毒力测试结果
表2多抗霉素对3株莱氏野村菌的抑制作用 处理浓度
（mg/mL）Nr13Nr19Nr41处理直
径（mm）抑菌率
（%）处理直
径（mm）抑菌率
（%）处理直
径（mm）抑菌率
（%）3.01.1587.3a0.8088.5a5.267.3a2.01.8579.6a1.2082.7b5.863.5a1.52.1576.2a1.5078.4b7.254.7a1.23.2064.6b2.7061.2b8.149.1a0.63.8557.5c3.2553.2c9.242.1a空白9.056.9515.9注：同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。
试验中采用生长速率法测定3%多抗霉素对不同地域的3株莱氏野村菌Nr13（山东）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）的抑菌活性，结果见表3，其中杀菌剂对病菌的EC50代表杀菌剂对病菌抑菌活性的高低[12]。由表3可知，来自河南的莱氏野村菌Nr41对3%多抗霉素的耐药性最强，其EC50值为 1054 0 mg/mL；其次是来自安徽的Nr19，其EC50值为 0.554 4 mg/mL；耐药性最弱的是来自山东的Nr13，其EC50值为0.437 7 mg/mL。表3多抗霉素对3株莱氏野村菌的耐药性
菌株菌株来源地毒力回归方程相关系数rEC50
（mg/mL）EC90
（mg/mL）Nr13山东平阴孝直y=0.443 9x 0.658 30.972 20.437 73.503 4Nr19安徽繁昌y=0.544 9x 0.639 60.951 90.554 43.005 3Nr41河南南阳y=0.384 0x 0.491 10.974 41.054 011.610 3
3结论与讨论
近年来，生防制剂作为有害生物综合治理（integrated pest management，简称IPM）的重要组成部分，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。丁子香酚、多抗霉素B、枯草芽孢杆菌和木霉菌均属于生物杀菌剂，对人畜安全，对自然环境安全、无污染，病原菌不易产生抗药性等[13-15]。本研究结果表明，3%多抗霉素对不同地域的莱氏野村菌Nr13（山东）、Nr19（安徽）和Nr41（河南）都具有抑制活性。但3%多抗霉素对这3株莱氏野村菌的抑制效果均表现出一定的差异性，其中对来自河南的Nr41耐药性最佳，其EC50值为1.054 0 mg/mL，这对筛选具有耐药性的莱氏野村菌菌株具有一定的参考意义。本研究中多抗霉素对莱氏野村菌的EC50值为0.437 7～1.054 0 mg/mL。刘保友采用菌丝生长速率法测定苹果斑点落叶病菌对多抗霉素的敏感性，结果表明，多抗霉素对多数苹果斑点落叶病病菌的菌丝生长具有良好的抑制效果，EC50值为4.165 5～103.462 1 mg/mL[16]。奉代力等采用生长速率法测定10%多抗霉素B 可湿性粉剂对番茄灰霉病菌的EC50值为6.32 mg/L[7]。张亚等采用菌丝生长抑制法对烟草赤星病进行室内毒力测定，结果表明，3%多抗霉素对烟草赤星病的EC50值为0.383 5 mg/mL[17]。可见，多抗霉素对苹果斑点落叶病、番茄灰霉病和烟草赤星病的EC50值都小于其对莱氏野村菌的EC50值，因此，农用抗生素多抗霉素和莱氏野村菌孢子复配使用时，在一定浓度下，多抗霉素可以杀死其他真菌，而莱氏野村菌不受影响，这样杀虫毒力强[4]的莱氏野村菌可以寄生在害虫体内，至其死亡，实现同时杀菌杀虫的目的，从而减少化学农药的使用量，缓解化学防治对环境的压力；同时为控制江苏省烟草、番茄等农作物的主要害虫和真菌病害，促进生态农业发展提供必要的技术支撑。
参考文献：
[1]罗宽，王庄. 利用拮抗的Pseudomonas spp.和无致病力的P. solanacearum防治青枯病的研究[J]. 植物病理学报，1983，13（1）：51-56.
[2]Wilcox W F，Harman G E.Control of Phytophthora root rots of soybeans and raspberries with Trichoderma and Gliocladium spp.[J]. Petria，1991，1：140-144.
[3]宋宝安. 新杂环农药：杀菌剂卷[M]. 北京：化学工业出版社，2008：432.
[4]裘维蕃，余永年，卯晓岚，等. 菌物学大全[M]. 北京：科学出版社，1998：960-961.
[5]齐永霞. 白僵菌和绿僵菌在植物根际的定殖及对几种土传植物病原真菌的抑制作用研究[D]. 合肥：安徽农业大学，2011：49.
[6]谭可欣. 新多氧霉素的生产与应用研究[D]. 武汉：华中农业大学，2005：32-34.
[7]奉代力，王强，郑纪慈，等. 几种杀菌剂对番茄灰霉病菌的抑菌效果对比研究[J]. 浙江农业学报，2013，25（1）：119-123.
[8]蒋婧婧. 莱氏野村菌遗传转化体系的构建[D]. 合肥：安徽农业大学，2010：34-35.
[9]姜兴印. 抗药木霉菌高效生防菌株生物学及其制剂加工技术[D]. 泰安：山东农业大学，2006：17-68.
[10]孙广宇，宗兆锋. 植物病理学实验技术[M]. 北京：中国农业出版社，2002.
[11]NY/T1156.2—2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第2部分： 抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法[S].
[12]奉代力，王强，陈丽萍，等. 2种常见番茄致病真菌对几种杀菌剂的敏感性测定[J]. 中国农学通报，2013，29（16）：96-99.
[13]魏艳敏. 生物农药及其应用技术问答[M]. 北京：中国农业大学出版社，2007.
[14]高立起，孙阁. 生物农药集锦[M]. 北京：中国农业出版社，2009.
[15]胡永红，曹峥，杨文革，等. 多效霉素研究进展[J]. 江苏农业科学，2013，41（12）：1-4.
[16]刘保友，王英姿，张伟，等. 苹果斑点落叶病病菌对多抗霉素的抗药性及其地理分布[J]. 中国果树，2013（4）：49-51.
[17]张亚，何可佳，刘薇，等. 几种药剂防治烟草赤星病的药效试验[J]. 烟草科技，2009（10）：61-64.刘丽华，王双，关磊. 北乌头乙醇提取液对菜青虫体内保护酶活性的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：146-147.