【摘 要】
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为克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)G基因和传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)VP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用PCR方法分别扩增出IHNV G基因和IPNV VP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNV G基因和IPNV VP2基因克隆到Pad-Track-CMV载体,经过线性化后与PAd-easy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及Not Ⅰ和H
【基金项目】
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上海市启明星项目——扬帆专项(22YF1459800);
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为克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)G基因和传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)VP2基因,并构建其重组腺病毒载体。利用PCR方法分别扩增出IHNV G基因和IPNV VP2基因,通过多基因片段同源重组技术将IHNV G基因和IPNV VP2基因克隆到Pad-Track-CMV载体,经过线性化后与PAd-easy-1载体在BJ5183菌体内同源重组,构建出重组腺病毒质粒,经PCR及Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定后,经Pac Ⅰ 线性化后用于转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,通过绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的表达来监控重组腺病毒的复制情况,用Western-blot法分别检测糖蛋白和VP2蛋白的表达,并测定重组病毒的滴度。结果显示,克隆出IHNV G基因和IPNV VP2基因,基因长度为3036 bp,构建出目的基因重组腺病毒载体。该病毒在HEK-293细胞中分别表达出蛋白分子质量约为58 kD和54 kD的产物,其滴度为1.0×109.5mL-1。结果表明,成功获得IHNV G基因和IPNV VP2基因重组腺病毒,该病毒在HEK-293细胞中滴度较高,能够稳定表达。
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