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中圖分类号 R361+.3 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）23-3210-06
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.08
摘 要 目的：考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用，并对其机制进行初步探讨。方法：采用MTT法测定25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱作用24 h对HSC-LX2细胞增殖的影响，计算细胞增殖抑制率。另取HSC-LX2细胞分为对照组（含5%胎牛血清的1640培养基）和原阿片碱低、中、高浓度组（100、200、400 μmol/L），作用24 h后，流式细胞术测定细胞凋亡率;荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法测定细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen Ⅲ）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1） mRNA的相对表达量，Western blot法测定细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白的相对表达量。结果：25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱对HSC- LX2细胞的增殖抑制率分别为0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相对表达量和α-SMA蛋白相对表达量均显著降低，MMP-2蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;原阿片碱中、高浓度组细胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相对表达量显著升高，α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相对表达量和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。 结论：原阿片碱可抑制HSC-LX2细胞增殖，诱导其凋亡，可降低α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1表达，升高MMP-2表达有关。
关键词 原阿片碱;肝星状细胞HSC-LX2;增殖;凋亡;机制
Inhibitory Effects of Protopine on the Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells HSC-LX2 and Its Mechanism Study
WU Xinyu1，2，LI Jing1，2，ZHANG Jinjuan3，LIAO Shanggao1，2，MEI Qing1，2，WU Yayun4，XI Xiaolan1，2（1.School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;2.National Engineering Research Center of Miao’s Medicines & Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， Ministry of Education， Guiyang 550004， China;3.School of Basic Medical Sciences， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;4.Dept. of Infectious Diseases， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate inhibitory effects of protopine on the proliferation of human hepatic stellate cells HSC-LX2 and to explore its mechanism preliminarily. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on the proliferation of HSC-LX2 cells. The inhibitory effect of cell proliferation was calculated. HSC-LX2 cells were divided into control group （1640 medium containing 5% fetal bovine serum）， protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （100， 200， 400 μmol/L）. After treated for 24 h. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， MMP-2 and TIMP-1 in cells. The protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and MMP-2 were detected by Western blot. RESULTS： The inhibitory rates of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on proliferation HSC-LX2 cells were 0， 6.9%， 18.7%， 34.2%， 48.9%， 53.9%， respectively. Compared with control group， mRNA expression of Collagen Ⅰ， TIMP-1 and protein expression of α-SMA were decreased significantly in protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups， while protein expression of MMP- 2 was increased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Apoptotic rate of HSC-LX2 cells and mRNA expression of MMP-2 were increased significantly in protopine medium-concentration and high-concentration groups， mRNA expression of α-SMA and Collagen Ⅲ， protein expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Protopine can induce the apoptosis of HSC-LX2 cells and inhibit their cell proliferation， and reduce the expression of a-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and TIMP-1， and increase the expression of MMP-2. KEYWORDS Protopine; Hepatic stellate cells HSC-LX2; Proliferation; Apoptosis; Mechanism
肝纤维化（Hepatic fibrosis）是指肝实质损伤后修复时通过形成瘢痕取代受损或破坏的肝组织，其实质是细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的合成与降解失衡，致使肝内弥漫性细胞外基质过度沉积。肝纤维化不是一个独立的疾病，也不是一个独立的诊断，而是许多慢性肝病发展的共同病理生理过程[1]。有研究表明，肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活变成肌成纤维细胞是肝纤维化的主要来源[2]，是合成和分泌ECM并可产生胶原酶的一种肝间质细胞[3]，在肝纤维化形成的过程中发挥关键作用[4]。在肝损伤时，各种因素刺激导致HSCs从静止状态转化为活化状态，其特征在于α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的过表达[5];通过自分泌或者旁分泌激活的HSCs增殖;以Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ为主的ECM过多沉积，最终形成肝纤维化[6]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种能降解ECM的酶，在静止的HSCs中，MMPs和组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）处于一种动态平衡，发生肝纤维化时平衡会被打破，TIMP-1被激活，MMP-2的活性被抑制[7-9]，从而影响ECM的稳态并导致肝纤维化。发生肝纤维化时，HSCs的数量显著增多，主要原因固然是因为其激活及增殖所致，但其凋亡的相对不足也可能是一个重要因素。
苗药“消疤草”（苗语称Vob hxenk dliangd）是贵州省黔东南苗族民间用于治疗瘢痕的单味药，能使明显凸出皮肤表面的瘢痕疙瘩明显缩小、变平。本课题组前期研究中发现，“消疤草”对大鼠免疫性肝纤维化具有很好的预防作用，并表现出抑制ECM形成的作用[10-12]。但“消疤草”中发挥抗肝纤维化作用的活性成分尚不清楚，作用机制亦不明确。本课题组在前期的药效研究基础上，进一步明确了原阿片碱（Protopine）、Macleayin E、β?卡波林、2-（4-羟基-3-甲氧苯基）-3-[N-2-（4-羟基苯基）乙基]氨基甲酰-5-[N-2-（4-羟基苯基）乙基]氨基甲酰乙烯基-7-甲氧基苯并二氢呋喃等4个单体可能是“消疤草”抗肝纤维化的有效成分[13]。原阿片碱是一种异喹啉类生物碱[14-15]，分子式为C20H19NO5。现代药理学研究证明，原阿片碱具有镇痛、抑制血小板聚集、松弛平滑肌、抗心律失常、抗肿瘤、抗肝损伤、抗胆碱酯酶等活性[16-17]，但其对HSCs和肝纤维化的影响目前尚不清楚。本研究拟通过考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的影响，初步探讨其对肝纤维化的作用，并从分子机制上探讨其可能的作用机制。原阿片碱的结构式见图1。
1 材料
1.1 仪器
2001HY-6003型CO2细胞培养箱、902型-80 ℃冰箱（美国 Thermo Fisher Scientific公司）;全波段多功能酶标仪、Universal HoodⅡ型成像分析仪（美国Bio-Tek公司）;PHS-25型数显台式pH计（上海越平科学仪器有限公司）;CP124C型电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司];Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）;BD FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）;TS-8型转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;Promo Vert型倒置显微镜[成贯仪器（上海）有限公司];SW-CJ-2D型超净工作台（苏州净化设备有限公司）;LDZX-50FBS型灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）;ZHWY-103D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）;K30型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）;Step One PlusTM型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）;XH-B型旋涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）。
1.2 药品与试剂
原阿片碱由廖尚高教授课题组提供，高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振检测纯度均在95%以上;磷酸盐缓冲液（PBS粉末，无锡傲锐东源生物科技有限公司，自配，pH 7.2～7.4，质量浓度：11.74 μg/mL）;RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号：8117293、1967534）;胎牛血清（美国ScienCell公司，批号：23954）;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒、RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂、二甲基亚砜（DMSO，细胞培养级）、MTT试剂、二喹啉甲酸（BCA）法蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180913、20180328、20180327、1213C0342、804W054、20180619）;SDS-PAGE蛋白上樣缓冲液（批号：Apr-23D）、一抗、二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司，批号：061218181026、091018181015）;磷脂结合蛋白（Annexin Ⅴ）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（上海七海复泰生物科技有限公司，批号：20180906）;Trizol试剂（美国Ambion Life Technologies公司，批号：101002）;RNA提取试剂盒（江苏康为世纪生物科技有限公司，批号：50250）;PCR扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：7E220E8）;免疫印迹化学发光（ECL）试剂（美国Millipore公司，批号：1722101）;α-SMA兔单克隆抗体、Collagen Ⅲ兔单克隆抗体、MMP-2兔单克隆抗体（美国Abcam公司，批号：5368、17673、1184）;Collagen Ⅰ兔多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：10423R）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（美国Affinity公司，批号：S0001、AF7021）;甲醇、乙醇、DMSO（天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯）;水为双蒸水;α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 细胞
HSC-LX2细胞购自美国Millipore公司。
2 方法
2.1 原阿片碱溶液的制备
用DMSO溶解原阿片碱，制成浓度为 100 mmol/L 的母溶液（现配现用），0.22 μm的微孔滤膜滤过除菌。
2.2 细胞培养
HSC-LX2细胞使用含有10%胎牛血清及100 u/mL 青霉素和100 μg /mL链霉素的1640高糖培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每24 h换一次液，待细胞融合至80%～90%时传代培养，取对数生长期细胞用于试验。
2.3 MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖抑制率
取对数生长期的HSC-LX2细胞，以0.2 %胰蛋白酶消化，以离心半径4 cm（下同）、1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用含10%胎牛血清1640培养液混悬细胞，以5×104 mL-1的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，边缘用200 μL 无菌的PBS填充以防干燥，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中放置贴壁。再将HSC-LX2细胞随机分为对照组、DMSO组和不同浓度的原阿片碱组（25、50、100、200、400、500 μmol/L），每组6个复孔。轻轻吸弃原培养孔中的培养液，对照组加入含5%胎牛血清1640培养基100 μL，DMSO组加入含5‰DMSO的1640培养基100 μL，原阿片碱组分别加入25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱的含5%胎牛血清1640培养基100 μL。药物作用24 h后，每孔分别避光加入5%MTT溶液10 μL，轻微混匀后，于37 ℃下继续孵育4 h，轻轻弃尽孔中溶液，每孔加入150 μL的DMSO，摇床振荡10 min。在酶标仪上测定490 nm波长处的光密度（OD），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）= [1-（给药组平均OD值/对照组平均OD 值）]×100%。
2.4 流式细胞术检测HSC-LX2细胞的凋亡率
取对数生长期的HSC-LX2细胞，以0.25%胰酶消化，以1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用含10%胎牛血清1640培养液混悬细胞，以7×104 mL-1的密度接种于12孔细胞培养板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中放置贴壁。再将HSC-LX2細胞随机分为对照组和原阿片碱低、中、高浓度组，每组3个复孔。轻轻吸弃培养孔中的培养液，对照组加入含5%胎牛血清的1640培养基1 mL，原阿片碱低、中、高浓度组加入100、200、400 μmol/L原阿片碱的含5%胎牛血清的1640培养基1 mL。药物作用24 h后，收集细胞上清，用PBS洗1次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化为单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min收集细胞，用PBS洗2次（2 000 r/min离心5 min），加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞;按照Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书标记细胞，处理后待机上样，利用流式细胞术检测细胞凋亡率。
2.5 RT-PCR法检测HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA表达的影响
取对数生长期的HSC-LX2细胞，按“2.4”项下方法培养、分组和加药，每孔2 mL。药物作用24 h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA用于合成cDNA。以GAPDH为内参基因，分别对α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP- 2、TIMP-1进行扩增，测定RNA的量及纯度。PCR反应体积为20 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。扩增反应结束后，建立PCR产物的溶解曲线（65～95 ℃），采用2-ΔΔct相对定量法[18]计算α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。
2.6 Western blot 法检测HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达的影响
取对数生长期的HSC-LX2细胞，按“2.4”项下方法培养、分组和加药，每孔8 mL。药物作用24 h后，加预冷后的PBS洗涤1次，加RIPA 蛋白裂解液（含PMSF蛋白酶抑制剂）后于冰盒上摇晃裂解离心提取上清液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取蛋白上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量[19]。加入5×蛋白上样缓冲液，于100 ℃加热5 min变性，然后进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉将膜封闭1.5 h，TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，分别加入一抗[GAPDH（1 ∶ 3 000）、α-SMA兔单克隆抗体（1 ∶ 10 000）、CollagenⅠ兔多克隆抗体（1 ∶ 1 000）、Collagen Ⅲ 兔单克隆抗体（1 ∶ 1 000）、MMP-2兔单克隆抗体（1 ∶ 1 000）]孵育，4 ℃冷藏过夜。第2天PVDF膜室温孵育15 min后，用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，与相应二抗[HRP标记的山羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000）]室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，用ECL发光试剂盒显影，以Image J 1.8.0 软件分析条带的灰度值，以目标蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值评价蛋白的相对表达量。
2.7 统计学方法
所有数据均采用SPSS 19.0软件进行分析，数据采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析或Dunnett’s t检验，两组样本均值之间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 3 结果
3.1 细胞增殖抑制率
与对照组比较，DMSO组细胞的OD值无明显变化（P>0.05），50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱组细胞的OD值均明显减小，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。随着原阿片碱浓度的增加，细胞的OD值逐渐减小。各组HSC-LX2细胞增殖抑制率的结果见表2。
3.2 细胞凋亡率
与对照组比较，中、高浓度原阿片碱组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。各组HSC- LX2细胞凋亡的散点图见图2，细胞凋亡率的结果见表3。
3.3 细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达
与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相对表达量显著降低;原阿片碱中、高浓度组细胞中α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相对表达量显著降低，MMP-2 mRNA相对表达量显著增强，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA相对表达量的结果见表4。
3.4 细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达
与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中α-SMA蛋白相对表达量显著降低，MMP-2 蛋白相对表达量显著增强;原阿片碱中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达的电泳图见图3，蛋白相对表达量的结果见表5。
4 讨论
肝纤维化是一种慢性、进行性、弥漫性的肝病理生理现象，属可逆病变。近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝纤维化的机制不同，但均具有一个共同点，即都有HSCs的参与，HSCs是纤维化反应的重要效应器和细胞因子的主要来源和靶点[20]。
本研究探讨了原阿片碱对HSC-LX2细胞增殖能力的影响，结果发现随着原阿片碱作用浓度的增加，细胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加。说明原阿片碱对HSC-LX2细胞有增殖抑制作用和促凋亡作用。HSCs在正常情况下处于静息状态，不表达α-SMA，因此，在肝纤维化的发生发展中，α-SMA的表达被认为是HSCs激活的指标[21]。本研究结果显示，原阿片碱处理后显著降低了HSC-LX2细胞中α-SMA mRNA及蛋白的表达，表明原阿片碱对HSC-LX2细胞的活化具有抑制作用。HSCs活化后向肌成纤维细胞转变，可分泌大量ECM成分，包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等，同时大量合成、分泌TIMPs，抑制MMPs活性，从而抑制ECM的降解，造成ECM产生与降解失衡，最终导致肝纤维化形成[22-26]。本研究结果显示，经原阿片碱处理后，HSC-LX2细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA及蛋白的表达降低，MMP-2 mRNA及蛋白的表达增强，TIMP-1 mRNA的表达降低，表明TIMP-1对MMPs的抑制得到改善，使得ECM的生成减少，降解增多。提示抑制HSCs的增殖和对HSCs中ECM的降解可能是通过MMP-2、 TIMP-1的调节来实现的。但本研究尚无确切的证据证明原阿片碱对TIMP-1蛋白表达有影响，对于这个问题后期将继续探讨。
原阿片碱是从“消疤草”里分出来的单体化合物，本研究发现其对HSC-LX2细胞有增殖抑制作用，提示“消疤草”发挥抗肝纤维化作用的药用成分中可能有原阿片碱，此发现对临床上治疗肝纤维也有一定的参考意义。
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（收稿日期：2019-08-06 修回日期：2019-10-18）
（编辑：邹丽娟）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.08
摘 要 目的：考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用，并对其机制进行初步探讨。方法：采用MTT法测定25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱作用24 h对HSC-LX2细胞增殖的影响，计算细胞增殖抑制率。另取HSC-LX2细胞分为对照组（含5%胎牛血清的1640培养基）和原阿片碱低、中、高浓度组（100、200、400 μmol/L），作用24 h后，流式细胞术测定细胞凋亡率;荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法测定细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen Ⅲ）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1） mRNA的相对表达量，Western blot法测定细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白的相对表达量。结果：25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱对HSC- LX2细胞的增殖抑制率分别为0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相对表达量和α-SMA蛋白相对表达量均显著降低，MMP-2蛋白相对表达量显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;原阿片碱中、高浓度组细胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相对表达量显著升高，α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相对表达量和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。 结论：原阿片碱可抑制HSC-LX2细胞增殖，诱导其凋亡，可降低α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1表达，升高MMP-2表达有关。
关键词 原阿片碱;肝星状细胞HSC-LX2;增殖;凋亡;机制
Inhibitory Effects of Protopine on the Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells HSC-LX2 and Its Mechanism Study
WU Xinyu1，2，LI Jing1，2，ZHANG Jinjuan3，LIAO Shanggao1，2，MEI Qing1，2，WU Yayun4，XI Xiaolan1，2（1.School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;2.National Engineering Research Center of Miao’s Medicines & Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， Ministry of Education， Guiyang 550004， China;3.School of Basic Medical Sciences， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;4.Dept. of Infectious Diseases， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate inhibitory effects of protopine on the proliferation of human hepatic stellate cells HSC-LX2 and to explore its mechanism preliminarily. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on the proliferation of HSC-LX2 cells. The inhibitory effect of cell proliferation was calculated. HSC-LX2 cells were divided into control group （1640 medium containing 5% fetal bovine serum）， protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （100， 200， 400 μmol/L）. After treated for 24 h. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， MMP-2 and TIMP-1 in cells. The protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and MMP-2 were detected by Western blot. RESULTS： The inhibitory rates of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on proliferation HSC-LX2 cells were 0， 6.9%， 18.7%， 34.2%， 48.9%， 53.9%， respectively. Compared with control group， mRNA expression of Collagen Ⅰ， TIMP-1 and protein expression of α-SMA were decreased significantly in protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups， while protein expression of MMP- 2 was increased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Apoptotic rate of HSC-LX2 cells and mRNA expression of MMP-2 were increased significantly in protopine medium-concentration and high-concentration groups， mRNA expression of α-SMA and Collagen Ⅲ， protein expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Protopine can induce the apoptosis of HSC-LX2 cells and inhibit their cell proliferation， and reduce the expression of a-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and TIMP-1， and increase the expression of MMP-2. KEYWORDS Protopine; Hepatic stellate cells HSC-LX2; Proliferation; Apoptosis; Mechanism
肝纤维化（Hepatic fibrosis）是指肝实质损伤后修复时通过形成瘢痕取代受损或破坏的肝组织，其实质是细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的合成与降解失衡，致使肝内弥漫性细胞外基质过度沉积。肝纤维化不是一个独立的疾病，也不是一个独立的诊断，而是许多慢性肝病发展的共同病理生理过程[1]。有研究表明，肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活变成肌成纤维细胞是肝纤维化的主要来源[2]，是合成和分泌ECM并可产生胶原酶的一种肝间质细胞[3]，在肝纤维化形成的过程中发挥关键作用[4]。在肝损伤时，各种因素刺激导致HSCs从静止状态转化为活化状态，其特征在于α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的过表达[5];通过自分泌或者旁分泌激活的HSCs增殖;以Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ为主的ECM过多沉积，最终形成肝纤维化[6]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种能降解ECM的酶，在静止的HSCs中，MMPs和组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）处于一种动态平衡，发生肝纤维化时平衡会被打破，TIMP-1被激活，MMP-2的活性被抑制[7-9]，从而影响ECM的稳态并导致肝纤维化。发生肝纤维化时，HSCs的数量显著增多，主要原因固然是因为其激活及增殖所致，但其凋亡的相对不足也可能是一个重要因素。
苗药“消疤草”（苗语称Vob hxenk dliangd）是贵州省黔东南苗族民间用于治疗瘢痕的单味药，能使明显凸出皮肤表面的瘢痕疙瘩明显缩小、变平。本课题组前期研究中发现，“消疤草”对大鼠免疫性肝纤维化具有很好的预防作用，并表现出抑制ECM形成的作用[10-12]。但“消疤草”中发挥抗肝纤维化作用的活性成分尚不清楚，作用机制亦不明确。本课题组在前期的药效研究基础上，进一步明确了原阿片碱（Protopine）、Macleayin E、β?卡波林、2-（4-羟基-3-甲氧苯基）-3-[N-2-（4-羟基苯基）乙基]氨基甲酰-5-[N-2-（4-羟基苯基）乙基]氨基甲酰乙烯基-7-甲氧基苯并二氢呋喃等4个单体可能是“消疤草”抗肝纤维化的有效成分[13]。原阿片碱是一种异喹啉类生物碱[14-15]，分子式为C20H19NO5。现代药理学研究证明，原阿片碱具有镇痛、抑制血小板聚集、松弛平滑肌、抗心律失常、抗肿瘤、抗肝损伤、抗胆碱酯酶等活性[16-17]，但其对HSCs和肝纤维化的影响目前尚不清楚。本研究拟通过考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的影响，初步探讨其对肝纤维化的作用，并从分子机制上探讨其可能的作用机制。原阿片碱的结构式见图1。
1 材料
1.1 仪器
2001HY-6003型CO2细胞培养箱、902型-80 ℃冰箱（美国 Thermo Fisher Scientific公司）;全波段多功能酶标仪、Universal HoodⅡ型成像分析仪（美国Bio-Tek公司）;PHS-25型数显台式pH计（上海越平科学仪器有限公司）;CP124C型电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司];Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）;BD FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）;TS-8型转移脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;Promo Vert型倒置显微镜[成贯仪器（上海）有限公司];SW-CJ-2D型超净工作台（苏州净化设备有限公司）;LDZX-50FBS型灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）;ZHWY-103D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）;K30型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）;Step One PlusTM型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）;XH-B型旋涡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）。
1.2 药品与试剂
原阿片碱由廖尚高教授课题组提供，高效液相色谱法（HPLC）和核磁共振检测纯度均在95%以上;磷酸盐缓冲液（PBS粉末，无锡傲锐东源生物科技有限公司，自配，pH 7.2～7.4，质量浓度：11.74 μg/mL）;RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号：8117293、1967534）;胎牛血清（美国ScienCell公司，批号：23954）;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒、RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂、二甲基亚砜（DMSO，细胞培养级）、MTT试剂、二喹啉甲酸（BCA）法蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180913、20180328、20180327、1213C0342、804W054、20180619）;SDS-PAGE蛋白上樣缓冲液（批号：Apr-23D）、一抗、二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司，批号：061218181026、091018181015）;磷脂结合蛋白（Annexin Ⅴ）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（上海七海复泰生物科技有限公司，批号：20180906）;Trizol试剂（美国Ambion Life Technologies公司，批号：101002）;RNA提取试剂盒（江苏康为世纪生物科技有限公司，批号：50250）;PCR扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：7E220E8）;免疫印迹化学发光（ECL）试剂（美国Millipore公司，批号：1722101）;α-SMA兔单克隆抗体、Collagen Ⅲ兔单克隆抗体、MMP-2兔单克隆抗体（美国Abcam公司，批号：5368、17673、1184）;Collagen Ⅰ兔多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：10423R）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（美国Affinity公司，批号：S0001、AF7021）;甲醇、乙醇、DMSO（天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯）;水为双蒸水;α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 细胞
HSC-LX2细胞购自美国Millipore公司。
2 方法
2.1 原阿片碱溶液的制备
用DMSO溶解原阿片碱，制成浓度为 100 mmol/L 的母溶液（现配现用），0.22 μm的微孔滤膜滤过除菌。
2.2 细胞培养
HSC-LX2细胞使用含有10%胎牛血清及100 u/mL 青霉素和100 μg /mL链霉素的1640高糖培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每24 h换一次液，待细胞融合至80%～90%时传代培养，取对数生长期细胞用于试验。
2.3 MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖抑制率
取对数生长期的HSC-LX2细胞，以0.2 %胰蛋白酶消化，以离心半径4 cm（下同）、1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用含10%胎牛血清1640培养液混悬细胞，以5×104 mL-1的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，边缘用200 μL 无菌的PBS填充以防干燥，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中放置贴壁。再将HSC-LX2细胞随机分为对照组、DMSO组和不同浓度的原阿片碱组（25、50、100、200、400、500 μmol/L），每组6个复孔。轻轻吸弃原培养孔中的培养液，对照组加入含5%胎牛血清1640培养基100 μL，DMSO组加入含5‰DMSO的1640培养基100 μL，原阿片碱组分别加入25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱的含5%胎牛血清1640培养基100 μL。药物作用24 h后，每孔分别避光加入5%MTT溶液10 μL，轻微混匀后，于37 ℃下继续孵育4 h，轻轻弃尽孔中溶液，每孔加入150 μL的DMSO，摇床振荡10 min。在酶标仪上测定490 nm波长处的光密度（OD），计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）= [1-（给药组平均OD值/对照组平均OD 值）]×100%。
2.4 流式细胞术检测HSC-LX2细胞的凋亡率
取对数生长期的HSC-LX2细胞，以0.25%胰酶消化，以1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用含10%胎牛血清1640培养液混悬细胞，以7×104 mL-1的密度接种于12孔细胞培养板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中放置贴壁。再将HSC-LX2細胞随机分为对照组和原阿片碱低、中、高浓度组，每组3个复孔。轻轻吸弃培养孔中的培养液，对照组加入含5%胎牛血清的1640培养基1 mL，原阿片碱低、中、高浓度组加入100、200、400 μmol/L原阿片碱的含5%胎牛血清的1640培养基1 mL。药物作用24 h后，收集细胞上清，用PBS洗1次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化为单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min收集细胞，用PBS洗2次（2 000 r/min离心5 min），加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞;按照Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书标记细胞，处理后待机上样，利用流式细胞术检测细胞凋亡率。
2.5 RT-PCR法检测HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA表达的影响
取对数生长期的HSC-LX2细胞，按“2.4”项下方法培养、分组和加药，每孔2 mL。药物作用24 h后，用Trizol试剂提取细胞总RNA用于合成cDNA。以GAPDH为内参基因，分别对α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP- 2、TIMP-1进行扩增，测定RNA的量及纯度。PCR反应体积为20 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。扩增反应结束后，建立PCR产物的溶解曲线（65～95 ℃），采用2-ΔΔct相对定量法[18]计算α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。
2.6 Western blot 法检测HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达的影响
取对数生长期的HSC-LX2细胞，按“2.4”项下方法培养、分组和加药，每孔8 mL。药物作用24 h后，加预冷后的PBS洗涤1次，加RIPA 蛋白裂解液（含PMSF蛋白酶抑制剂）后于冰盒上摇晃裂解离心提取上清液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取蛋白上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量[19]。加入5×蛋白上样缓冲液，于100 ℃加热5 min变性，然后进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉将膜封闭1.5 h，TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，分别加入一抗[GAPDH（1 ∶ 3 000）、α-SMA兔单克隆抗体（1 ∶ 10 000）、CollagenⅠ兔多克隆抗体（1 ∶ 1 000）、Collagen Ⅲ 兔单克隆抗体（1 ∶ 1 000）、MMP-2兔单克隆抗体（1 ∶ 1 000）]孵育，4 ℃冷藏过夜。第2天PVDF膜室温孵育15 min后，用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，与相应二抗[HRP标记的山羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000）]室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，用ECL发光试剂盒显影，以Image J 1.8.0 软件分析条带的灰度值，以目标蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值评价蛋白的相对表达量。
2.7 统计学方法
所有数据均采用SPSS 19.0软件进行分析，数据采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析或Dunnett’s t检验，两组样本均值之间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 3 结果
3.1 细胞增殖抑制率
与对照组比较，DMSO组细胞的OD值无明显变化（P>0.05），50、100、200、400、500 μmol/L原阿片碱组细胞的OD值均明显减小，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。随着原阿片碱浓度的增加，细胞的OD值逐渐减小。各组HSC-LX2细胞增殖抑制率的结果见表2。
3.2 细胞凋亡率
与对照组比较，中、高浓度原阿片碱组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。各组HSC- LX2细胞凋亡的散点图见图2，细胞凋亡率的结果见表3。
3.3 细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达
与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相对表达量显著降低;原阿片碱中、高浓度组细胞中α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相对表达量显著降低，MMP-2 mRNA相对表达量显著增强，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA相对表达量的结果见表4。
3.4 细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达
与对照组比较，原阿片碱低、中、高浓度组细胞中α-SMA蛋白相对表达量显著降低，MMP-2 蛋白相对表达量显著增强;原阿片碱中、高浓度组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相对表达量显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。各组HSC-LX2细胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达的电泳图见图3，蛋白相对表达量的结果见表5。
4 讨论
肝纤维化是一种慢性、进行性、弥漫性的肝病理生理现象，属可逆病变。近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝纤维化的机制不同，但均具有一个共同点，即都有HSCs的参与，HSCs是纤维化反应的重要效应器和细胞因子的主要来源和靶点[20]。
本研究探讨了原阿片碱对HSC-LX2细胞增殖能力的影响，结果发现随着原阿片碱作用浓度的增加，细胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加。说明原阿片碱对HSC-LX2细胞有增殖抑制作用和促凋亡作用。HSCs在正常情况下处于静息状态，不表达α-SMA，因此，在肝纤维化的发生发展中，α-SMA的表达被认为是HSCs激活的指标[21]。本研究结果显示，原阿片碱处理后显著降低了HSC-LX2细胞中α-SMA mRNA及蛋白的表达，表明原阿片碱对HSC-LX2细胞的活化具有抑制作用。HSCs活化后向肌成纤维细胞转变，可分泌大量ECM成分，包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等，同时大量合成、分泌TIMPs，抑制MMPs活性，从而抑制ECM的降解，造成ECM产生与降解失衡，最终导致肝纤维化形成[22-26]。本研究结果显示，经原阿片碱处理后，HSC-LX2细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA及蛋白的表达降低，MMP-2 mRNA及蛋白的表达增强，TIMP-1 mRNA的表达降低，表明TIMP-1对MMPs的抑制得到改善，使得ECM的生成减少，降解增多。提示抑制HSCs的增殖和对HSCs中ECM的降解可能是通过MMP-2、 TIMP-1的调节来实现的。但本研究尚无确切的证据证明原阿片碱对TIMP-1蛋白表达有影响，对于这个问题后期将继续探讨。
原阿片碱是从“消疤草”里分出来的单体化合物，本研究发现其对HSC-LX2细胞有增殖抑制作用，提示“消疤草”发挥抗肝纤维化作用的药用成分中可能有原阿片碱，此发现对临床上治疗肝纤维也有一定的参考意义。
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（收稿日期：2019-08-06 修回日期：2019-10-18）
（编辑：邹丽娟）