论文部分内容阅读
目的:研究Endocan沉默对人髓系白血病细胞株增殖、细胞周期、凋亡和化疗药物敏感性的影响,并探讨其作用机制。研究方法:通过RT-PCR和Western blot筛选出Endocan表达量相对较高的两株人髓系白血病细胞株（U937、K562）。构件Endocan-shRNA慢病毒载体,转染至U937、K562白血病细胞株,通过RT-PCR和Western blot确定该慢病毒载体能抑制细胞Endocan表达。用CCK-8法、Western blot、流式细胞术检测Endocan表达沉默对U937、K562细胞增殖、细胞周期、凋亡的影响。CCK-8法选择出5-FU的IC50值,来处理U937、K562细胞,流式细胞术检测Endocan表达沉默对U937、K562细胞化疗药物敏感性的影响。同时Western blot检测凋亡相关蛋白的变化。用稳定转染的K562白血病细胞建立白血病动物模型,进一步研究Endocan表达沉默在动物体内成瘤机制。观察实验鼠肿瘤生长情况,HE染色和TUNEL法观察细胞凋亡、坏死情况,免疫组化法分析PCNA、Cyclin D1的表达,Western blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白。通过Western blot检测NF-κB、P65、p-P65、NF-κB inhibitor alpha（IκBα）、p-IκBα、核P65的表达。EMSA测定NF-κB的DNA结合活性。结果:人髓系白血病细胞株U937、K562中Endocan表达量相对高,成功建立Endocan-shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默Endocan基因表达。Endocan表达沉默,能够下调PCNA表达,抑制U937、K562细胞增殖;使Cyclin D1表达下降,细胞发生G1期阻滞;抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9、cleaved PARP表达增加,从而促进白血病细胞凋亡。Endocan表达沉默,可增强U937、K562细胞对5-FU药物的敏感性。进一步通过白血病动物实验发现,Endocan沉默可加强5-FU对肿瘤生长的抑制作用。HE染色和TUNEL法显示Endocan沉默与5-FU可使细胞凋亡增加,两者共同作用细胞凋亡最严重。免疫组化显示,Endocan沉默与5-FU可使细胞PCNA、Cyclin D1表达下降,两者共同作用细胞PCNA、Cyclin D1的表达最低,并且Endocan沉默可增强5-FU对凋亡相关蛋白的表达调控。此外,我们还发现,沉默Endocan表达,可通过NF-κB抑制剂α（IκBα）表达的增加、p-κBα、p65和核p65表达的降低以及NF-κB DNA结合活性的降低,来抑制核因子-κB（NF-κB）的活性。结论:Endocan沉默,可抑制NF-κB活性,抑制人髓系白血病细胞增殖,干扰细胞周期,诱导白血病细胞发生凋亡,提示Endocan有可能成为髓系白血病治疗的新靶点。