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摘要
植物蛋白的功能性质是制约其应用的重要因素，酶水解是改善蛋白质功能性质的常用主要手段。高压不但能改变蛋白质分子结构而改善蛋白质的功能性质，而且能促进酶水解蛋白质生成新的多肽产物。综述了高压对蛋白质结构的影响，高压对蛋白质酶水解的影响以及高压对蛋白质功能性质的影响等方面的研究进展。
关键词高压；蛋白质；结构；酶水解；功能性质
中图分类号S188；TS20文献标识码A文章编号0517-6611（2015）10-292-03
AbstractThe undesirable properties of vegetable proteins were the main hamper for their applications. Enzymatic modification was broadly used to improve the functional properties. High pressure can not only affect protein conformation that influence the functional properties but also promote the enzymatic proteolysis. In this paper， the research advance of the formation changes and functional properties variations and the enzymatic hydrolysis of proteins subjected to high pressure were reviewed.
Key words High pressure； Protein； Conformation； Enzymatic hydrolysis； Functional properties
蛋白质的功能性质对食品生产加工、储藏和产品的品质都有直接的影响[1]。大豆蛋白、花生蛋白等植物蛋白因功能性质较差其应用也受到限制。蛋白质的大小、极性和非极性残基、分子柔韧性、带电荷情况和氨基酸组成等结构特征都会影响蛋白质的功能性质[2]。因此，改善蛋白质功能性质一直受到研究者关注。改性的方法包括化学、热处理、酶法和高压处理等[3-7]。高压技术在牛奶保藏方面的作用在100年前就被人们认识。但是直至20世纪90年代高压技术在食品中的应用才受到真正重视和推广。一方面是高压处理可通过抑制或杀灭食品中有害微生物和酶延长食品保质期[8-11]；另外，高压可通过改变生物大分子的结构而改善食品的功能特性。高压处理使蛋白质的疏水基团暴露、去分子折叠以及聚集而改变蛋白质的功能性质[9，12-14]，并且高压处理还能促进蛋白质的酶解改性。高压不但加快蛋白酶解速度、提高降解率并且影响产物种类。目前的报道主要是关于高压和酶解结合处理后蛋白质降解程度和降解速度的变化；不同离子强度、温度和不同pH条件下高压处理结果的比较；高压和酶解处理后蛋白质功能性质改变；高压与不同蛋白酶结合的处理结果比较等方面的研究。 笔者对现有的研究进展进行总结。
1 高压对蛋白质结构的影响
高压可能给蛋白质分子结构带来整体或者局部的改变，蛋白质中的共价键对低于1 000～1 500 MPa的压力几乎都不敏感[9，12]。在没有共价键形成或断裂的情况下对蛋白质结构最具影响的就是水合作用。蛋白质分子可以通过氢键、静电作用和疏水作用等形式与水分子结合。高压使氢键变得更加稳定[15-16]，静电作用在高压下则被削弱[17]，疏水作用在高压下同样变弱[18-19]。各因素综合作用的结果是蛋白质的水合作用得到了增强。高压下维系蛋白质四级结构的静电和疏水作用减弱，因此200 MPa左右的压力可致蛋白的亚基解离，解离后的亚基仍有保持活性乃至发生构象转变的可能，这是通过化学或者热变性无法实现的[20]。高压首先破坏的是维系三级结构的残基间最弱的非共价键，然后是蛋白质-水之间的相互作用，接下来才是二级结构。高压下变性的蛋白质和热变性蛋白质其二级结构有很大的差异。对红移型绿色荧光蛋白的研究发现，58 ℃、780 MPa处理后β折叠减少而使蛋白结构有序程度降低，而热变性的蛋白主要是发生不可逆的蛋白质的聚集[12，21]。不同的研究还表明，蛋白质的不同区域对压力的敏感程度不同，β螺旋比β折叠敏感，侧链和支链较主链更加敏感。对蛋白二硫键氧化还原酶的研究也表明，500 MPa以下压力时β螺旋对压力更加敏感，而500～900 MPa时β折叠的损失更多[22]。Knudsen等发现，β乳球蛋白经300～450 MPa的处理后酶解生成的2种肽是蛋白质的D和G链水解的产物，这表明2条链在高压下从β乳球蛋白的桶状结构中解离出来。另外，Cys66- Cys160附近酶切位点相关肽产物在未经高压处理的蛋白水解产物中含量更高，这表明这些位点在高压处理后被埋藏[23]。蛋白受高压初期分子保持完整而水分子渗入其中而形成鼓胀而直至引发蛋白分子的去折叠[24-25]。Belloque等对β乳球蛋白的研究发现，F、G和H链形成的结构区域更能耐受高压，200 MPa处理下蛋白去折叠较400 MPa时更快，37 ℃去折叠较25 ℃更快，表明高压对蛋白结构的影响与压力、温度和pH都有关。高压下变性的蛋白在压力释放后可能恢复其天然状态。但恢复情况与外界环境和处理压力及时间有关[25]。相关的研究还发现，高压能使变性的蛋白质重新折叠而恢复生物活性[26-29]。Wang等的研究发现，乙醇变性的大豆伴球蛋白经高压后分子内氢键更加牢固，分子重排形成了有序的高级分子结构，在200～400 MPa压力间分子的表面疏水性提高，高于500 MPa后表面疏水性降低；而乙醇变性的大豆球蛋白在高压下去折叠，Tyr和Phe残基暴露到分子表面；可见不同的蛋白质在高压下可能有不同的变化，同种分子在不同的压力范围也会有不同的变化[26]。Dang等通过研究Cy3荧光染料标记的藻青蛋白经高压后的荧光和荧光共振能量转移行为发现，高压处理后染料和藻青蛋白的距离变近，间接说明压力可能使蛋白质分子的构造发生改变[30]。压力可引起蛋白质的高级结构的变化，变化的情况与蛋白质本身和处理的条件都有关。因此，这样的过程是可以也有必要根据实际需求进行选择、调节和控制的过程。 2 高压对蛋白质酶解的影响
高压对蛋白质水解的影响主要表现在对水解速度、程度和水解产物的影响等方面。Knudsen等发现，β乳球蛋白经150 MPa的处理其胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解程度和水解产物都没有变化，但是300～450 MPa的处理使蛋白水解速度提高了5～10倍，并且产物中肽的组成发生了变化[23]。对牛乳乳清蛋白经高压处理后的研究表明，糜蛋白酶和胰蛋白酶在经100和200 MPa处理后具有高于300 MPa处理的水解程度，而胃蛋白酶仅能降解经高压处理的蛋白，β乳白蛋白不论经高压处理与否都不能被糜蛋白酶降解。因此高压处理对蛋白水解的影响不但与处理压力有关而且与酶也有关[31]。Quiros等将卵清蛋白高压处理后经糜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，对产物分析表明，虽然抗血管紧张素转化酶（ACE）肽的含量并未提高，但是蛋白质水解程度和其他一些多肽的含量却改变了，这可能与蛋白分子不同区域和片段对高压的敏感程度不同有关，酶解增强的原因可能与蛋白结构改变带来的更多酶切位点暴露、高压影响酶的活性和高压影响底物-酶的相互作用有关[32]。Belloque等对β乳球蛋白的研究表明，只有高压使蛋白的结构发生明显变化时才促进蛋白水解[25]。Zeece等对β乳球蛋白经高压处理后模拟胃环境水解的研究表明，600～800 MPa的高压处理10 min能使蛋白在1 min内完全水解解，并且水解得到的分子量低的小肽更多。这可能是降解速度太快，中等大小的肽来不及累积就已经被进一步降解[33]。Chicon等对乳清蛋白经高压和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解的研究发现，400 MPa、30 min的处理后酶解加速，高压处理后的酶解生成更多中等大小的肽，而常压酶解时中间产物增加慢，并且产生后很快被降解为更小的片段[34]。Zeece和Chicon得到中等大小肽的结果并不一致。卵清蛋白在400 MPa经不同时间的胃蛋白酶处理，均无完整的蛋白残留，高压处理显著促进蛋白的水解，与常压酶解相比水解初期出现较多的大分子疏水性肽，这和Chicon的研究结果一致。这可能与初期快速酶解中间产物大量累积有关，也可能与新酶切位点暴露而生成新的酶解产物有关[35]。对卵清蛋白经400 MPa处理和胃蛋白酶降解的研究发现，高压处理后的酶解产物在产物的种类和数量上都和常压酶解不同，因此高压处理极可能改变了蛋白质的构造暴露了新的酶切位点[36]。Belloque等对β乳球蛋白的研究还发现，高压导致的蛋白质亚基解离、蛋白质分子膨胀带来的酶切位点暴露、蛋白质柔性的增加都增加了酶和酶切位点的接近机会而促进酶解。如果酶解在高压处理后进行，则需在蛋白质恢复其天然结构前进行[25]。目前的研究表明，高压能促进蛋白质的酶解并且影响酶解产物种类，不同的酶、压力、温度、pH和处理时间所得到的结果都不相同。因此，探索高压促进酶解的机理对于利用和控制高压促进都有十分重要的意义。虽然高压促进花生蛋白水解的研究鲜有报道，但是研究发现，热变性的花生蛋白和天然花生蛋白在碱性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解时，其水解率虽无显著差异而水解产物却不同[35]。因此，高压辅助的花生球蛋白酶解可能在产物、水解速度和程度上都和常压酶解不同而值得关注。
3 高压及高压辅助酶解对蛋白质功能性质的影响
蛋白质的功能性质主要包括：与水合作用相关的性质，如吸水保水性、湿润性、膨胀性、分散性和溶解性等；与蛋白质分子之间的相互作用有关的性质，如沉淀、胶凝作用、黏性等；与蛋白质的表面性质相关的如起泡、乳化与乳化稳定性等[3]。改善天然蛋白的功能性质以满足不同食品的需求是植物蛋白质应用的关键问题。如上所述高压能影响蛋白质的水合作用，蛋白质的分子结构和蛋白质的酶水解，因此高压势必对蛋白质的功能性质带来直接或者间接的影响。Chicon等发现，乳清蛋白经400 MPa和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后其热稳定性比天然蛋白和常压下酶解产物都高；在低蛋白质浓度时400 MPa、10 min处理的酶解产物的乳化性有显著提高，而400 MPa、30 min处理却有最差的乳化性；蛋白溶解性在处理前后并没有差异，乳化性的提高可能与高压引起的分子柔性改变极性基团的分布和疏水残基的暴露发生变化有关[34]。在pH 3.0时对大豆蛋白经200～600 MPa处理其溶解性提高而热稳定性降低[37]。Wang等对乙醇变性的大豆蛋白的研究却发现，200～300 MPa的压力可以提高变性蛋白的溶解度，压力升高溶解度因为蛋白质聚集而降低[26]。对大豆7S、11S和大豆分离蛋白的100～600 MPa处理表明，各种蛋白的溶解性改变与蛋白质、处理压力和介质pH都有关系。7S蛋白在400 MPa处理后获得最高的乳化性和表面疏水性而11S蛋白则在200 MPa处理后获得最大值。大豆分离蛋白在400 MPa处理后达到最高乳化能力同时表面疏水性很低，可能是400 MPa下7S蛋白解离为部分或者完全变性的单体而是表面活性增加，而11S蛋白多肽链的解聚而产生聚集影响了分离蛋白的表面疏水性[38]。可见高压对蛋白质功能性质的影响受多方面因素影响，并且不同功能性质的变化去势常常不同，因此能根据需求生产不同的蛋白质改性产品是必要的也是可能的。
4 前景
高压下蛋白质分子去折叠、疏水基团的暴露、分子柔性的改变和二硫键的破坏都带来蛋白质构造的变化，这些变化不但影响蛋白质的功能性质，而且还通过影响蛋白质的酶解的进程和产物而影响改性蛋白的功能性质。改性过程受蛋白质种类、处理的条件和蛋白酶的种类等多因素的影响，使之成为一个复杂的，同时又是一个可以从多方面进行调节控制的，并且可能得到多样化结果的过程，而调节和控制必须建立在掌握过程机理的基础之上。因此，研究高压处理过程中蛋白质的结构变化与蛋白质水解被促进间的联系，采用不同的高压和酶解条件处理以得到具有不同功能性质的改性蛋白质都具有较好的研究前景。
安徽农业科学2015年 参考文献
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植物蛋白的功能性质是制约其应用的重要因素，酶水解是改善蛋白质功能性质的常用主要手段。高压不但能改变蛋白质分子结构而改善蛋白质的功能性质，而且能促进酶水解蛋白质生成新的多肽产物。综述了高压对蛋白质结构的影响，高压对蛋白质酶水解的影响以及高压对蛋白质功能性质的影响等方面的研究进展。
关键词高压；蛋白质；结构；酶水解；功能性质
中图分类号S188；TS20文献标识码A文章编号0517-6611（2015）10-292-03
AbstractThe undesirable properties of vegetable proteins were the main hamper for their applications. Enzymatic modification was broadly used to improve the functional properties. High pressure can not only affect protein conformation that influence the functional properties but also promote the enzymatic proteolysis. In this paper， the research advance of the formation changes and functional properties variations and the enzymatic hydrolysis of proteins subjected to high pressure were reviewed.
Key words High pressure； Protein； Conformation； Enzymatic hydrolysis； Functional properties
蛋白质的功能性质对食品生产加工、储藏和产品的品质都有直接的影响[1]。大豆蛋白、花生蛋白等植物蛋白因功能性质较差其应用也受到限制。蛋白质的大小、极性和非极性残基、分子柔韧性、带电荷情况和氨基酸组成等结构特征都会影响蛋白质的功能性质[2]。因此，改善蛋白质功能性质一直受到研究者关注。改性的方法包括化学、热处理、酶法和高压处理等[3-7]。高压技术在牛奶保藏方面的作用在100年前就被人们认识。但是直至20世纪90年代高压技术在食品中的应用才受到真正重视和推广。一方面是高压处理可通过抑制或杀灭食品中有害微生物和酶延长食品保质期[8-11]；另外，高压可通过改变生物大分子的结构而改善食品的功能特性。高压处理使蛋白质的疏水基团暴露、去分子折叠以及聚集而改变蛋白质的功能性质[9，12-14]，并且高压处理还能促进蛋白质的酶解改性。高压不但加快蛋白酶解速度、提高降解率并且影响产物种类。目前的报道主要是关于高压和酶解结合处理后蛋白质降解程度和降解速度的变化；不同离子强度、温度和不同pH条件下高压处理结果的比较；高压和酶解处理后蛋白质功能性质改变；高压与不同蛋白酶结合的处理结果比较等方面的研究。 笔者对现有的研究进展进行总结。
1 高压对蛋白质结构的影响
高压可能给蛋白质分子结构带来整体或者局部的改变，蛋白质中的共价键对低于1 000～1 500 MPa的压力几乎都不敏感[9，12]。在没有共价键形成或断裂的情况下对蛋白质结构最具影响的就是水合作用。蛋白质分子可以通过氢键、静电作用和疏水作用等形式与水分子结合。高压使氢键变得更加稳定[15-16]，静电作用在高压下则被削弱[17]，疏水作用在高压下同样变弱[18-19]。各因素综合作用的结果是蛋白质的水合作用得到了增强。高压下维系蛋白质四级结构的静电和疏水作用减弱，因此200 MPa左右的压力可致蛋白的亚基解离，解离后的亚基仍有保持活性乃至发生构象转变的可能，这是通过化学或者热变性无法实现的[20]。高压首先破坏的是维系三级结构的残基间最弱的非共价键，然后是蛋白质-水之间的相互作用，接下来才是二级结构。高压下变性的蛋白质和热变性蛋白质其二级结构有很大的差异。对红移型绿色荧光蛋白的研究发现，58 ℃、780 MPa处理后β折叠减少而使蛋白结构有序程度降低，而热变性的蛋白主要是发生不可逆的蛋白质的聚集[12，21]。不同的研究还表明，蛋白质的不同区域对压力的敏感程度不同，β螺旋比β折叠敏感，侧链和支链较主链更加敏感。对蛋白二硫键氧化还原酶的研究也表明，500 MPa以下压力时β螺旋对压力更加敏感，而500～900 MPa时β折叠的损失更多[22]。Knudsen等发现，β乳球蛋白经300～450 MPa的处理后酶解生成的2种肽是蛋白质的D和G链水解的产物，这表明2条链在高压下从β乳球蛋白的桶状结构中解离出来。另外，Cys66- Cys160附近酶切位点相关肽产物在未经高压处理的蛋白水解产物中含量更高，这表明这些位点在高压处理后被埋藏[23]。蛋白受高压初期分子保持完整而水分子渗入其中而形成鼓胀而直至引发蛋白分子的去折叠[24-25]。Belloque等对β乳球蛋白的研究发现，F、G和H链形成的结构区域更能耐受高压，200 MPa处理下蛋白去折叠较400 MPa时更快，37 ℃去折叠较25 ℃更快，表明高压对蛋白结构的影响与压力、温度和pH都有关。高压下变性的蛋白在压力释放后可能恢复其天然状态。但恢复情况与外界环境和处理压力及时间有关[25]。相关的研究还发现，高压能使变性的蛋白质重新折叠而恢复生物活性[26-29]。Wang等的研究发现，乙醇变性的大豆伴球蛋白经高压后分子内氢键更加牢固，分子重排形成了有序的高级分子结构，在200～400 MPa压力间分子的表面疏水性提高，高于500 MPa后表面疏水性降低；而乙醇变性的大豆球蛋白在高压下去折叠，Tyr和Phe残基暴露到分子表面；可见不同的蛋白质在高压下可能有不同的变化，同种分子在不同的压力范围也会有不同的变化[26]。Dang等通过研究Cy3荧光染料标记的藻青蛋白经高压后的荧光和荧光共振能量转移行为发现，高压处理后染料和藻青蛋白的距离变近，间接说明压力可能使蛋白质分子的构造发生改变[30]。压力可引起蛋白质的高级结构的变化，变化的情况与蛋白质本身和处理的条件都有关。因此，这样的过程是可以也有必要根据实际需求进行选择、调节和控制的过程。 2 高压对蛋白质酶解的影响
高压对蛋白质水解的影响主要表现在对水解速度、程度和水解产物的影响等方面。Knudsen等发现，β乳球蛋白经150 MPa的处理其胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解程度和水解产物都没有变化，但是300～450 MPa的处理使蛋白水解速度提高了5～10倍，并且产物中肽的组成发生了变化[23]。对牛乳乳清蛋白经高压处理后的研究表明，糜蛋白酶和胰蛋白酶在经100和200 MPa处理后具有高于300 MPa处理的水解程度，而胃蛋白酶仅能降解经高压处理的蛋白，β乳白蛋白不论经高压处理与否都不能被糜蛋白酶降解。因此高压处理对蛋白水解的影响不但与处理压力有关而且与酶也有关[31]。Quiros等将卵清蛋白高压处理后经糜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，对产物分析表明，虽然抗血管紧张素转化酶（ACE）肽的含量并未提高，但是蛋白质水解程度和其他一些多肽的含量却改变了，这可能与蛋白分子不同区域和片段对高压的敏感程度不同有关，酶解增强的原因可能与蛋白结构改变带来的更多酶切位点暴露、高压影响酶的活性和高压影响底物-酶的相互作用有关[32]。Belloque等对β乳球蛋白的研究表明，只有高压使蛋白的结构发生明显变化时才促进蛋白水解[25]。Zeece等对β乳球蛋白经高压处理后模拟胃环境水解的研究表明，600～800 MPa的高压处理10 min能使蛋白在1 min内完全水解解，并且水解得到的分子量低的小肽更多。这可能是降解速度太快，中等大小的肽来不及累积就已经被进一步降解[33]。Chicon等对乳清蛋白经高压和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解的研究发现，400 MPa、30 min的处理后酶解加速，高压处理后的酶解生成更多中等大小的肽，而常压酶解时中间产物增加慢，并且产生后很快被降解为更小的片段[34]。Zeece和Chicon得到中等大小肽的结果并不一致。卵清蛋白在400 MPa经不同时间的胃蛋白酶处理，均无完整的蛋白残留，高压处理显著促进蛋白的水解，与常压酶解相比水解初期出现较多的大分子疏水性肽，这和Chicon的研究结果一致。这可能与初期快速酶解中间产物大量累积有关，也可能与新酶切位点暴露而生成新的酶解产物有关[35]。对卵清蛋白经400 MPa处理和胃蛋白酶降解的研究发现，高压处理后的酶解产物在产物的种类和数量上都和常压酶解不同，因此高压处理极可能改变了蛋白质的构造暴露了新的酶切位点[36]。Belloque等对β乳球蛋白的研究还发现，高压导致的蛋白质亚基解离、蛋白质分子膨胀带来的酶切位点暴露、蛋白质柔性的增加都增加了酶和酶切位点的接近机会而促进酶解。如果酶解在高压处理后进行，则需在蛋白质恢复其天然结构前进行[25]。目前的研究表明，高压能促进蛋白质的酶解并且影响酶解产物种类，不同的酶、压力、温度、pH和处理时间所得到的结果都不相同。因此，探索高压促进酶解的机理对于利用和控制高压促进都有十分重要的意义。虽然高压促进花生蛋白水解的研究鲜有报道，但是研究发现，热变性的花生蛋白和天然花生蛋白在碱性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解时，其水解率虽无显著差异而水解产物却不同[35]。因此，高压辅助的花生球蛋白酶解可能在产物、水解速度和程度上都和常压酶解不同而值得关注。
3 高压及高压辅助酶解对蛋白质功能性质的影响
蛋白质的功能性质主要包括：与水合作用相关的性质，如吸水保水性、湿润性、膨胀性、分散性和溶解性等；与蛋白质分子之间的相互作用有关的性质，如沉淀、胶凝作用、黏性等；与蛋白质的表面性质相关的如起泡、乳化与乳化稳定性等[3]。改善天然蛋白的功能性质以满足不同食品的需求是植物蛋白质应用的关键问题。如上所述高压能影响蛋白质的水合作用，蛋白质的分子结构和蛋白质的酶水解，因此高压势必对蛋白质的功能性质带来直接或者间接的影响。Chicon等发现，乳清蛋白经400 MPa和胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后其热稳定性比天然蛋白和常压下酶解产物都高；在低蛋白质浓度时400 MPa、10 min处理的酶解产物的乳化性有显著提高，而400 MPa、30 min处理却有最差的乳化性；蛋白溶解性在处理前后并没有差异，乳化性的提高可能与高压引起的分子柔性改变极性基团的分布和疏水残基的暴露发生变化有关[34]。在pH 3.0时对大豆蛋白经200～600 MPa处理其溶解性提高而热稳定性降低[37]。Wang等对乙醇变性的大豆蛋白的研究却发现，200～300 MPa的压力可以提高变性蛋白的溶解度，压力升高溶解度因为蛋白质聚集而降低[26]。对大豆7S、11S和大豆分离蛋白的100～600 MPa处理表明，各种蛋白的溶解性改变与蛋白质、处理压力和介质pH都有关系。7S蛋白在400 MPa处理后获得最高的乳化性和表面疏水性而11S蛋白则在200 MPa处理后获得最大值。大豆分离蛋白在400 MPa处理后达到最高乳化能力同时表面疏水性很低，可能是400 MPa下7S蛋白解离为部分或者完全变性的单体而是表面活性增加，而11S蛋白多肽链的解聚而产生聚集影响了分离蛋白的表面疏水性[38]。可见高压对蛋白质功能性质的影响受多方面因素影响，并且不同功能性质的变化去势常常不同，因此能根据需求生产不同的蛋白质改性产品是必要的也是可能的。
4 前景
高压下蛋白质分子去折叠、疏水基团的暴露、分子柔性的改变和二硫键的破坏都带来蛋白质构造的变化，这些变化不但影响蛋白质的功能性质，而且还通过影响蛋白质的酶解的进程和产物而影响改性蛋白的功能性质。改性过程受蛋白质种类、处理的条件和蛋白酶的种类等多因素的影响，使之成为一个复杂的，同时又是一个可以从多方面进行调节控制的，并且可能得到多样化结果的过程，而调节和控制必须建立在掌握过程机理的基础之上。因此，研究高压处理过程中蛋白质的结构变化与蛋白质水解被促进间的联系，采用不同的高压和酶解条件处理以得到具有不同功能性质的改性蛋白质都具有较好的研究前景。
安徽农业科学2015年 参考文献
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