【摘 要】
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目的 构建CD88基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证CD88是miR-619-5p的靶基因.方法 预测miR-619-5p的下游调控位点,扩增CD88基因的3'-UTR序列(野生型,WT),合成miR-619-5p
【机 构】
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潍坊医学院基础医学院山东省高校免疫学重点实验室,山东潍坊261053;潍坊医学院公共卫生学院
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目的 构建CD88基因3\'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证CD88是miR-619-5p的靶基因.方法 预测miR-619-5p的下游调控位点,扩增CD88基因的3\'-UTR序列(野生型,WT),合成miR-619-5p与CD88基因3\'-UTR结合位点突变序列(突变型,Mut),分别与pGL3-Control vector连接.将miR-619-5p激动剂(mimics)及对照分别与pGL3-Control vector、pGL3-CD883\'-UTR Mut、pGL3-CD883\'-UTR WT、pRL-TK质粒共转染至HEK-293T细胞中,检测其荧光素酶活力.通过转染使胃癌细胞系BGC-823的miR-619-5p表达增加,再通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测其CD88的表达水平.结果 预测表明miR-619-5p与CD88基因3\'-UTR存在互补结合位点;测序后证明荧光素酶报告载体构建成功;双荧光素酶报告实验表明,CD88是miR-619-5p的靶基因;qRT-PCR及Western blot实验结果表明,miR-619-5p过表达后与对照组相比CD88蛋白表达降低(P＜0.05).结论 CD88是miR-619-5p的一个靶基因.miR-619-5p能够与CD88基因的3\'-UTR互补结合,miR-619-5p主要在转录后水平抑制CD88表达.
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