论文部分内容阅读
【摘要】目的：建立保暖风的薄层色谱鉴别方法和紫丁香苷HPLC含量测定方法。方法：薄层色谱以保暖风对照药材和7-羟基香豆素、紫丁香苷对照品作对照；含量测定采用HPLC法测定紫丁香苷含量，色谱柱：SPOLAR C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相：乙腈-水（9∶91）；检测波长：264nm；流速：1.0ml/min，柱温：35℃。结果：薄层色谱斑点圆整、清晰，重复性好。紫丁香苷进样量在0.04132～2.066μg范围内线性关系良好（r=1.0000），平均回收率为101.2%，RSD=1.3%（n=6）。结论：所建立的方法简便快捷，重复性好，结果准确可靠，能有效控制保暖风的质量，可作为保暖风的质量标准的主要控制指标。
【关键词】保暖风；7-羟基香豆素，紫丁香苷，薄层色谱法，高效液相色谱法
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）17-0015-03
TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl.TANG Xiu-ling1 TANG Xiu-li2
1.Guangxi Institute for Food and Drug Control， Nanning 530021，China；
2.Liuzhou Liutie Central Hospital， Liuzhou 545007，ChinaAbstract：Objective To establish the method of TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl. Methods The matched control medica ，7-hydroxycoumarin and syringoside were used as comparison in TLC； the content of syringoside was determined by HPLC， SPOLAR C18 chromatographic column （5 μ m， 4.6mm × 250mm） was used with acetonitrile-water（9∶91）， the detection wavelength was set at 264 nm ， the flow rate was 1.0 ml/min， and the temperature was 35℃. Results The TLC spots were round and clear with good repeatability. The syringoside sample size showed a good linear relationship at the range of 0.04132～2.066μg （r=1.0000）； the average recovery was 101.2% and the RSD was 1.3% （n=6）.Conclusion The method is convenient， fast and repeatabld， the result is accurate and reliable. Edgeworthia chrysantha Lindl. quality can be effectively controled by it， which can be used as the main index of the quality standard.
Keywords：Edgeworthia chrysantha Lindl.； 7-hydroxycoumarin； syringoside； TLC； HPLC
保暖风为传统瑶药“五虎九牛十八钻七十二风”之风药，来源为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl. 的全株[1]。分布河南、陕西、长江流域及以南各省区，广西各地均有分布[1-3]。保暖风味甘、性温，归肾、肝经，其根、茎、花可分别人药，根和茎具有舒筋活络，消肿止痛功效；花具有养阴安神、明目、祛障翳之功效[4]。为保护、收集、整理和发展广西民间瑶药资源，广西食品药品监督管理局拟出版《广西瑶族习用药材质量标准（第一卷）》，对瑶族习用药材进行质量控制指标研究，建立质量标准，保暖风是其中品种之一。
保暖风（结香）化学成分研究报道[4-6]主要含香豆素类、黄酮类、甾类、有机酸化合物等，其中伞型花内酯、西瑞香素等成分含量测定方法已有报道[7]。本文采用7-羟基香豆素、紫丁香苷对照品及保暖风对照药材作薄层色谱鉴别的对照，建立两个薄层色谱鉴别，结果斑点圆整、清晰，重复性好；用高效液相色谱法测定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制备供试品，用乙腈-水（9∶91）为流动相，紫丁香苷与其它杂质峰分离良好，按照《中国药典》2010年版一部附录[8]“中药质量标准分析方法验证指导原则”进行方法学验证，结果表明该方法专属性强，稳定性、重现性好，结果可靠，可作为保暖风质量控制。
1仪器与试药
1.1仪器Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，Empower色谱工作站；MILLIPORE纯水处理器；MIKRO 22R型高速冷冻离心机；梅特勒电子分析天平。
1.2试药7-羟基香豆素（批号：11739-200501）、紫丁香苷（批号：111574-200201）购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。保暖风分别采集于广西金秀县桐木镇、资源县两水乡、贺州市开山镇、金秀县长垌乡、桂林市、金秀县六巷乡，柳州市鹿寨县、桂林市龙胜县、桂林市恭城县等地，经鉴定为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl。 2薄层色谱鉴别
2.17-羟基香豆素的鉴别取保暖风粉末1g，加甲醇30ml，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材1g，同法制定对照药材溶液，再取7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液2～4μl、对品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（6.5∶3.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑点显色清晰。置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，见图1。
2.2紫丁香苷的鉴别取本品各2g，加甲醇50ml，超声30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，加石油醚（60～90℃）提取两次，每次25ml，弃去石油醚液，再加三氯甲烷提取两次，每次25ml，弃去三氯甲烷液，水液加水饱和的正丁醇提取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材2g，同法制定对照药材溶液，再取紫丁香苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μl、对品溶液2μl ，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的斑点，见图2。
3紫丁香苷含量测定
3.1色谱条件色谱柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）；检测波长：264nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃，流动相：乙腈-水（9∶91），进样量10μl。在上述色谱条件下，紫丁香苷峰形良好，与相邻峰达到基线分离。
3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液的制备取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
3.2.2供试品溶液的制备取本品粉末约1g，精密称定，置烧瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3稳定性考察对同一供试品溶液（BNF-5），每隔一定时间测定一次，共测定9次，RSD为0.95%。试验表明，在24小时内被测物稳定。
3.4线性范围考察精密称取紫丁香苷对照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分别置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl，按3.1色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果表明：紫丁香苷进样量在0.04132～2.066μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=2.5173×106X -3.0990×103，r=1.0000。
3.5精密度试验
3.5.1仪器精密度试验取同一供试品溶液（BNF-5），按“3.1”色谱条件，连续测定6次，进样量为10μl。结果6次测定结果紫丁香苷峰面积的平均值为902489，RSD为0.49%（n=6）。试验表明，本法的精密度良好。
3.5.2重复性试验取同一供试品（BNF-5），按拟订的方法平行测定6份，结果紫丁香苷含量的平均值为1.76mg/g，RSD 为1.6%（n=6）。果表明本法的重复性好。
3.6准确度试验精密称取已知含量的保暖风0.5g（BNF-5，紫丁香苷含量为1.7622mg/g），共六份，分别精密加入紫丁香苷甲醇溶液（紫丁香苷含量0.7710mg/ml）1ml，挥去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、测定，计算加样回收率，结果紫丁香苷的加样回收率为101.2%，RSD=1.3%（n=6），符合方法学的要求，详见表1。
3.7耐用性考察用不同品牌色谱柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）、Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）、XBridge C18（5μm，4.6mm×250mm）进行分离、测定，结果紫丁香苷在上述色谱柱中均得到良好的分离，理论板数分别为5638、10368、5763。平均含量分别为1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD为0.56%。
3.8样品测定按“3.2.1”、“3.2.2”制备对照品溶液和10批样品溶液，照“3.1”项下色谱条件测定，按干燥品计算样品中的紫丁香苷的含量。10批样品中含量最高的是BNF-5为0.196%；含量最低的是BNF-6为0.023%。结果见表2。
【关键词】保暖风；7-羟基香豆素，紫丁香苷，薄层色谱法，高效液相色谱法
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）17-0015-03
TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl.TANG Xiu-ling1 TANG Xiu-li2
1.Guangxi Institute for Food and Drug Control， Nanning 530021，China；
2.Liuzhou Liutie Central Hospital， Liuzhou 545007，ChinaAbstract：Objective To establish the method of TLC and HPLC for syringoside of Edgeworthia chrysantha Lindl. Methods The matched control medica ，7-hydroxycoumarin and syringoside were used as comparison in TLC； the content of syringoside was determined by HPLC， SPOLAR C18 chromatographic column （5 μ m， 4.6mm × 250mm） was used with acetonitrile-water（9∶91）， the detection wavelength was set at 264 nm ， the flow rate was 1.0 ml/min， and the temperature was 35℃. Results The TLC spots were round and clear with good repeatability. The syringoside sample size showed a good linear relationship at the range of 0.04132～2.066μg （r=1.0000）； the average recovery was 101.2% and the RSD was 1.3% （n=6）.Conclusion The method is convenient， fast and repeatabld， the result is accurate and reliable. Edgeworthia chrysantha Lindl. quality can be effectively controled by it， which can be used as the main index of the quality standard.
Keywords：Edgeworthia chrysantha Lindl.； 7-hydroxycoumarin； syringoside； TLC； HPLC
保暖风为传统瑶药“五虎九牛十八钻七十二风”之风药，来源为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl. 的全株[1]。分布河南、陕西、长江流域及以南各省区，广西各地均有分布[1-3]。保暖风味甘、性温，归肾、肝经，其根、茎、花可分别人药，根和茎具有舒筋活络，消肿止痛功效；花具有养阴安神、明目、祛障翳之功效[4]。为保护、收集、整理和发展广西民间瑶药资源，广西食品药品监督管理局拟出版《广西瑶族习用药材质量标准（第一卷）》，对瑶族习用药材进行质量控制指标研究，建立质量标准，保暖风是其中品种之一。
保暖风（结香）化学成分研究报道[4-6]主要含香豆素类、黄酮类、甾类、有机酸化合物等，其中伞型花内酯、西瑞香素等成分含量测定方法已有报道[7]。本文采用7-羟基香豆素、紫丁香苷对照品及保暖风对照药材作薄层色谱鉴别的对照，建立两个薄层色谱鉴别，结果斑点圆整、清晰，重复性好；用高效液相色谱法测定紫丁香苷含量，采用甲醇回流提取制备供试品，用乙腈-水（9∶91）为流动相，紫丁香苷与其它杂质峰分离良好，按照《中国药典》2010年版一部附录[8]“中药质量标准分析方法验证指导原则”进行方法学验证，结果表明该方法专属性强，稳定性、重现性好，结果可靠，可作为保暖风质量控制。
1仪器与试药
1.1仪器Waters 2695高效液相色谱仪，2487紫外检测器，Empower色谱工作站；MILLIPORE纯水处理器；MIKRO 22R型高速冷冻离心机；梅特勒电子分析天平。
1.2试药7-羟基香豆素（批号：11739-200501）、紫丁香苷（批号：111574-200201）购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。保暖风分别采集于广西金秀县桐木镇、资源县两水乡、贺州市开山镇、金秀县长垌乡、桂林市、金秀县六巷乡，柳州市鹿寨县、桂林市龙胜县、桂林市恭城县等地，经鉴定为瑞香科植物结香Edgeworthia chrysantha Lindl。 2薄层色谱鉴别
2.17-羟基香豆素的鉴别取保暖风粉末1g，加甲醇30ml，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材1g，同法制定对照药材溶液，再取7-羟基香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液2～4μl、对品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（6.5∶3.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加至斑点显色清晰。置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，见图1。
2.2紫丁香苷的鉴别取本品各2g，加甲醇50ml，超声30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，加石油醚（60～90℃）提取两次，每次25ml，弃去石油醚液，再加三氯甲烷提取两次，每次25ml，弃去三氯甲烷液，水液加水饱和的正丁醇提取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取保暖风对照药材2g，同法制定对照药材溶液，再取紫丁香苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液5～10μl、对品溶液2μl ，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色和对照品谱相应的位置上，显相同的斑点，见图2。
3紫丁香苷含量测定
3.1色谱条件色谱柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）；检测波长：264nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃，流动相：乙腈-水（9∶91），进样量10μl。在上述色谱条件下，紫丁香苷峰形良好，与相邻峰达到基线分离。
3.2溶液的制备
3.2.1对照品溶液的制备取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
3.2.2供试品溶液的制备取本品粉末约1g，精密称定，置烧瓶中，精密加甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3稳定性考察对同一供试品溶液（BNF-5），每隔一定时间测定一次，共测定9次，RSD为0.95%。试验表明，在24小时内被测物稳定。
3.4线性范围考察精密称取紫丁香苷对照品10.33mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取1.0、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0.、20.0ml，分别置50、20、20、20、20、20、20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为不同浓度的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl，按3.1色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果表明：紫丁香苷进样量在0.04132～2.066μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y=2.5173×106X -3.0990×103，r=1.0000。
3.5精密度试验
3.5.1仪器精密度试验取同一供试品溶液（BNF-5），按“3.1”色谱条件，连续测定6次，进样量为10μl。结果6次测定结果紫丁香苷峰面积的平均值为902489，RSD为0.49%（n=6）。试验表明，本法的精密度良好。
3.5.2重复性试验取同一供试品（BNF-5），按拟订的方法平行测定6份，结果紫丁香苷含量的平均值为1.76mg/g，RSD 为1.6%（n=6）。果表明本法的重复性好。
3.6准确度试验精密称取已知含量的保暖风0.5g（BNF-5，紫丁香苷含量为1.7622mg/g），共六份，分别精密加入紫丁香苷甲醇溶液（紫丁香苷含量0.7710mg/ml）1ml，挥去甲醇，按“3.2.2”的方法提取、测定，计算加样回收率，结果紫丁香苷的加样回收率为101.2%，RSD=1.3%（n=6），符合方法学的要求，详见表1。
3.7耐用性考察用不同品牌色谱柱：SPOLAR C18（5μm，4.6mm×250mm）、Alltima C18（5μm，4.6mm×250mm）、XBridge C18（5μm，4.6mm×250mm）进行分离、测定，结果紫丁香苷在上述色谱柱中均得到良好的分离，理论板数分别为5638、10368、5763。平均含量分别为1.76mg/g、1.78mg/g、1.77mg/g，RSD为0.56%。
3.8样品测定按“3.2.1”、“3.2.2”制备对照品溶液和10批样品溶液，照“3.1”项下色谱条件测定，按干燥品计算样品中的紫丁香苷的含量。10批样品中含量最高的是BNF-5为0.196%；含量最低的是BNF-6为0.023%。结果见表2。