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摘要[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育（HLCMS）不育系粤泰A（YTA）中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA，为Northern Blot检测提供阳性定量标准品，并可作为凝胶阻滞试验的底物，用于研究与恢复基因编码产物的相互作用，从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物，利用不育系YTA为材料，PCR扩增获得相应片段，分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒，测序鉴定后酶切线性化，补平粘性末端，以rN4为底物、用依赖于DNA的 RNA聚合酶进行体外转录，转录产物用DNase处理除去DNA模板，纯化并测定RNA浓度，并用Northern Blot 验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA，经检测orf216浓度为1.286 μg/μl，A260/A280为2.01；orfH79浓度为1.006 μg/μl，A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一，纯度较高，可用于体外大量获取目的RNA。
关键词水稻；红莲型细胞质雄性不育；体外转录；Northern Blot
中图分类号S511；Q37文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03497-02
基金项目国家自然基金项目（31170296）。
作者简介华宇峰（1988- ），男，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学研究。*通讯作者，副教授，硕士生导师，博士，从事水稻功能基因方面的研究工作。
植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）现象在高等植物中普遍存在，是指植物雄性器官丧失功能，而雌性器官发育正常，表现为母性遗传和花粉败育的生物学现象[1]。Levings最早报道玉米CMS与细胞质的线粒体基因组异常有关，并以此提出线粒体DNA是导致CMS产生的载体[2]。在大多数情况下，CMS植株花粉败育的发生与线粒体基因组分子内或分子间频繁重组所形成的嵌合基因有关[3]，这种线粒体基因组的非正常重组产生嵌合开放阅读框最终导致了花粉败育[4]。CMS导致的花粉败育可以被恢复基因Rf所恢复。CMS/Rf系统减少了手工去雄的工作程序，因此，其在商业用杂交种子生产过程中就显得尤为重要。CMS除了在农业上的重要性之外，研究CMS的特性也为解析植物中线粒体基因和核基因在遗传上的相互作用带来了方便。
Boro II（BT）、Honglian（HL）和Wild abortive（WA）是主要的3种胞质雄性不育类型，均用于三系杂交水稻的培育[5]。易平等以atp6为探针，采用同源系列法，证明了HLCMS线粒体基因组中atp6orfH79构成的嵌合基因与CMS有关[6]。liu等克隆了一个与HLCMS相关的基因片段HLsp1[7]。李丕顺通过TAILPCR获得HLsp1侧翼序列，并预测其下游有一个编码216个氨基酸的开放阅读框orf216[8]。陈为等发现orf216的表达能导致花粉败育[9]。
体外转录技术是在体外条件下合成RNA的过程。其基本原理是将目的基因片段连接到带有噬菌体启动子的克隆载体下游，以构建好的质粒DNA或其线性化片段为模板，用依赖于DNA的RNA聚合酶，在4种核糖核酸存在条件下，体外转录生成目的RNA。现已成为一种分子生物学技术，用于制备RNA，目前已经有商业化的试剂盒销售。应用体外转录体系合成的单链RNA可用于研究RNA的加工、RNA结构特性及其翻译；还可用于合成RNA杂交探针，灵敏度极高，特异性强，优于切口平移法获到的探针[10]。笔者通过基因克隆和体外转录技术，获得水稻红莲型细胞质雄性不育（HLCMS）不育系粤泰A（YTA）中的2个雄性不育基因orf216和orfH79各自对应的mRNA，以期为进一步研究orf216的分子作用机制奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。HLCMS不育系YTA植株和大肠杆菌DH5α，均由中南民族大學武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供，克隆载体pGEMT Easy Vector，购自Promega公司。
1.1.2主要试剂。限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA连接酶，购自TAKARA公司；T4 DNA 聚合酶，购自碧云天公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen公司；SP6 RNA体外转录试剂盒，购自Promega公司；North2South？Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit，均购自Thermo scientific公司；其他试剂均为国产试剂分析纯，市售。
1.2方法
1.2.1引物设计[6]。根据易平等发表的orfH79序列设计引物orfH79F/orfH79R，根据实验室克隆的orf216序列设计引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。
1.2.2载体构建。取新鲜的水稻YTA叶片，用CTAB法提取基因组DNA，分别用orfH79和orf216的序列引物扩增基因组DNA，获得orfH79和orf216目的片段。将片段分别与克隆载体pGEMT Easy Vector 在体外进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于蓝白斑筛选平板上，于37 ℃恒温培养箱光照培养过夜。挑取白色菌落扩大培养，SDS碱裂解法提取培养菌株质粒DNA，并用PCR扩增检测其是否为阳性，检测为阳性者送南京金斯瑞公司测序验证。
1.2.3体外转录。用限制性内切酶NcoI将测序正确的质粒DNA进行酶切，酶切产物纯化后用T4 DNA 聚合酶将粘性末端补平，再一次纯化，得到可用于体外转录的线性质粒DNA。按照SP6 RNA体外转录试剂盒说明书配制体外转录体系，进行体外转录。转录结束后，用RNasefree DNase消化模板质粒DNA，纯化产物，分别得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop仪（Thermo scientific公司，Nano Drop 2000）测定RNA浓度和纯度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。
1.2.4Northern Blot检测。应用Northern Blot方法，利用生物素标记的寡聚核苷酸作为探针，检测所得到的RNA是否为特异的目标RNA。
2结果与分析
2.1载体构建以水稻红莲型细胞质雄性不育（HLCMS）不育系粤泰A（YTA）为材料，利用特异引物进行PCR扩增分别得到orfH79和orf216目的片段，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对质粒DNA进行特异引物PCR扩增，扩增结果为阳性者送南京金斯瑞公司测序，测序结果均正确。
3讨论
基因的体外转录体系现在已经广泛用于RNA的制备。通过体外转录，可以获得多种RNA，包括SiRNA、tRNA及其他类型的RNA，用于研究基因的表达调控，以及研究RNA的结构和功能等。
关键词水稻；红莲型细胞质雄性不育；体外转录；Northern Blot
中图分类号S511；Q37文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03497-02
基金项目国家自然基金项目（31170296）。
作者简介华宇峰（1988- ），男，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学研究。*通讯作者，副教授，硕士生导师，博士，从事水稻功能基因方面的研究工作。
植物细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterile，CMS）现象在高等植物中普遍存在，是指植物雄性器官丧失功能，而雌性器官发育正常，表现为母性遗传和花粉败育的生物学现象[1]。Levings最早报道玉米CMS与细胞质的线粒体基因组异常有关，并以此提出线粒体DNA是导致CMS产生的载体[2]。在大多数情况下，CMS植株花粉败育的发生与线粒体基因组分子内或分子间频繁重组所形成的嵌合基因有关[3]，这种线粒体基因组的非正常重组产生嵌合开放阅读框最终导致了花粉败育[4]。CMS导致的花粉败育可以被恢复基因Rf所恢复。CMS/Rf系统减少了手工去雄的工作程序，因此，其在商业用杂交种子生产过程中就显得尤为重要。CMS除了在农业上的重要性之外，研究CMS的特性也为解析植物中线粒体基因和核基因在遗传上的相互作用带来了方便。
Boro II（BT）、Honglian（HL）和Wild abortive（WA）是主要的3种胞质雄性不育类型，均用于三系杂交水稻的培育[5]。易平等以atp6为探针，采用同源系列法，证明了HLCMS线粒体基因组中atp6orfH79构成的嵌合基因与CMS有关[6]。liu等克隆了一个与HLCMS相关的基因片段HLsp1[7]。李丕顺通过TAILPCR获得HLsp1侧翼序列，并预测其下游有一个编码216个氨基酸的开放阅读框orf216[8]。陈为等发现orf216的表达能导致花粉败育[9]。
体外转录技术是在体外条件下合成RNA的过程。其基本原理是将目的基因片段连接到带有噬菌体启动子的克隆载体下游，以构建好的质粒DNA或其线性化片段为模板，用依赖于DNA的RNA聚合酶，在4种核糖核酸存在条件下，体外转录生成目的RNA。现已成为一种分子生物学技术，用于制备RNA，目前已经有商业化的试剂盒销售。应用体外转录体系合成的单链RNA可用于研究RNA的加工、RNA结构特性及其翻译；还可用于合成RNA杂交探针，灵敏度极高，特异性强，优于切口平移法获到的探针[10]。笔者通过基因克隆和体外转录技术，获得水稻红莲型细胞质雄性不育（HLCMS）不育系粤泰A（YTA）中的2个雄性不育基因orf216和orfH79各自对应的mRNA，以期为进一步研究orf216的分子作用机制奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究对象。HLCMS不育系YTA植株和大肠杆菌DH5α，均由中南民族大學武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供，克隆载体pGEMT Easy Vector，购自Promega公司。
1.1.2主要试剂。限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Marker和T4 DNA连接酶，购自TAKARA公司；T4 DNA 聚合酶，购自碧云天公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen公司；SP6 RNA体外转录试剂盒，购自Promega公司；North2South？Biotin Random Prime Labeling Kit、North2South Chemiluminescent Hybridization和Detection Kit，均购自Thermo scientific公司；其他试剂均为国产试剂分析纯，市售。
1.2方法
1.2.1引物设计[6]。根据易平等发表的orfH79序列设计引物orfH79F/orfH79R，根据实验室克隆的orf216序列设计引物orf216F/orf216R。引物由南京金斯瑞公司合成。
1.2.2载体构建。取新鲜的水稻YTA叶片，用CTAB法提取基因组DNA，分别用orfH79和orf216的序列引物扩增基因组DNA，获得orfH79和orf216目的片段。将片段分别与克隆载体pGEMT Easy Vector 在体外进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于蓝白斑筛选平板上，于37 ℃恒温培养箱光照培养过夜。挑取白色菌落扩大培养，SDS碱裂解法提取培养菌株质粒DNA，并用PCR扩增检测其是否为阳性，检测为阳性者送南京金斯瑞公司测序验证。
1.2.3体外转录。用限制性内切酶NcoI将测序正确的质粒DNA进行酶切，酶切产物纯化后用T4 DNA 聚合酶将粘性末端补平，再一次纯化，得到可用于体外转录的线性质粒DNA。按照SP6 RNA体外转录试剂盒说明书配制体外转录体系，进行体外转录。转录结束后，用RNasefree DNase消化模板质粒DNA，纯化产物，分别得到orfH79 mRNA和orf216 mRNA。nano drop仪（Thermo scientific公司，Nano Drop 2000）测定RNA浓度和纯度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物。
1.2.4Northern Blot检测。应用Northern Blot方法，利用生物素标记的寡聚核苷酸作为探针，检测所得到的RNA是否为特异的目标RNA。
2结果与分析
2.1载体构建以水稻红莲型细胞质雄性不育（HLCMS）不育系粤泰A（YTA）为材料，利用特异引物进行PCR扩增分别得到orfH79和orf216目的片段，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并对质粒DNA进行特异引物PCR扩增，扩增结果为阳性者送南京金斯瑞公司测序，测序结果均正确。
3讨论
基因的体外转录体系现在已经广泛用于RNA的制备。通过体外转录，可以获得多种RNA，包括SiRNA、tRNA及其他类型的RNA，用于研究基因的表达调控，以及研究RNA的结构和功能等。