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【摘要】 目的 探讨甲状腺乳头状癌（PTC）中BRAFV600E突变与淋巴结转移之间的相关性。方法 采用PCR直接测序法检测65例PTC患者肿瘤细胞DNA中BRAFV600E点突变，分析其与淋巴结转移的相关性。结果 BRAFV600E点突变在PTC中的发生率为61.5%（40/65）,其中40例BRAFV600E突变的PTC中有14例淋巴结转移，而未突变的25例患者中有淋巴结转移者10例，BRAFV600E点突变与淋巴结转移无相关性（P=0.7932）。结论 BRAFV600E可能参与PTC的发生，但与PTC淋巴结转移无相关性。
【关键词】 甲状腺乳头状癌； BRAF； 淋巴结转移
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中PTC占甲状腺癌的85%~90%。PTC的发生发展涉及到多种基因的突变和重组，例如RET/PTC1, RET/PTC3的重排，NRAS突变和P53突变失活。2002年Davie等［1］报道在66%的恶性黑色素瘤和一系列其它肿瘤中检测到BRAF基因突变,该突变主要见于BRAF基因第11和15外显子的激酶结构域内,80% 以上的突变都是第15外显子位核苷酸上的单碱基颠换,致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。随后在PTC中也检测到了BRAFV600E突变,突变率在28%～83% 之间 ［2~4］。近2年有报道称，BRAFV 600E突变的PTC更容易发生淋巴结转移，但两者之间的确切关系仍需要进一步的研究证明。因此，笔者检测了65例PTC中BRAFV600E突变的突变情况,旨在进一步探讨BRAFV600E突变和PTC淋巴结转移之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究收集了65例PTC患者的手术切除的新鲜组织，由有经验的病理学医生分辨瘤旁的正常组织和肿瘤组织，并立即保存于液氮中。所有病例均由2名以上病理学教授按照世界卫生组织分类标准进行形态学观察，并独立作出诊断。
1.2 方法
1.2.1 DNA 抽提 所有冰冻组织DNA均采用OMEGA DNA 抽提试剂盒提供的方法进行抽提，并采用nanodrop检测DNA的完整性和浓度，所有的DNA的OD值都大于1.9。
1.2.2 引物合成 所需扩增引物均由上海生工生物工程有限公司合成，BRAF-F：ACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCT，BRAF-R：CTGATTTTTGTGAATACTGGGAACT，扩增长度为318 bp。
1.2.3 PCR反应 所用试剂均购于上海申能博彩生物科技有限公司。PCR反应体系为20 L终体积，内含双蒸水13.4 L， 10×PCR buffer（含Mg2+）2 L, dNT 200(mmol/L)0.4 L,上下游引物(10 pmol/L)各1 L, Taq 酶(5 u/L) 0.2 L, 模板2.0 L (约100 ng)。PCR反应条件：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 min, 共35个循环。每一次实验都以双蒸水作为阴性对照。取PCR产物5 L，2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色, 凝胶成像仪下观察并照相。
1.2.4 PCR产物测序 将PCR 产物送往上海博尚生物技术有限公司纯化并测序，测序序列采用PCR前向引物，采用chromos软件进行序列读取，并将测序结果经BLAST基因服务网站进行比对，以确定有无突变。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件, 组间比较用χ2 检验。
2 结果
本次研究收集了65例PTC患者，其中40例患者的肿瘤组织含有BRAFV600E突变（图1），突变率为61.2%，而瘤旁的正常组织均无此突变。40例含有BRAFV600E点突变的患者有14例(35%)发生了淋巴结转移，25例未含有该突变的患者有10例(40%)发生了淋巴结转移，该相关性差异无统计学意义（P=0.7932）（表1）。
3 讨论
不同的研究报导中BRAFV600E在PTC中的突变率不尽相同，从28％～83％不等，主要与不同地域及民族背景等流行病学因素有关。此外，有学者认为可能与PTC的亚型分布有关，经典型PTC、滤泡亚型PTC和甲状腺滤泡状癌（FTC）组织的BRAF V600E突变率分别为51％、24.1％和1.4％。本实验共收集65例PTC患者，突变率为61.5%。Sitham andam［5］和Mercer等［6］证实，BRAF基因为MAPK通路中最强的活化因子,将BRAF突变体转染到NIH3T3细胞内,其转化效率比野生型BRAF增强了70～138倍,从而更加支持BRAF突变可能通过RAS/RAF/MEK/MAPK通路致癌的机制。Knauf等［7］通过诱导转基因鼠甲状腺细胞发生BRAFV600E突变而引发PTC形成的实验也充分说明了这一点。
Kebebw等［8］回顾分析314例分化型甲状腺癌的临床病理资料，报道了典型PTC BRAFV600E基因突变与多种因素有关，包括患者年龄大、有颈部淋巴结或远处转移、临床分期高(Ⅲ～Ⅳ期)，术后有癌组织残留和复发(平均随访6年)。故认为BRAF V600E突变与甲状腺癌的侵袭性表型(aggressive phenotype)有关联，典型PTC中BRAF V600E突变基因型的术后癌组织残留和复发风险高。而多因素分析揭示，只有BRAF V600E突变和颈部淋巴结转移是典型PTC术后复发、转移的独立预后因素。因此，BRAF V600E突变基因型诊断对选择扩大手术切除和减少PTC的术后病灶残留和复发有指导价值。Xing等［9］的219例多中心研究资料揭示，初次手术时癌已侵犯甲状腺周围组织、有颈部淋巴结转移和甲状腺癌已处于进展期(Ⅲ～Ⅳ期)都与PTC的BRAF基因突变有显著相关性。术后随访(平均15个月)揭示BRAF基因突变型(V600E)比野生型PTC的复发率高(25％VS 9％)，即使是Ⅰ～Ⅱ期肿瘤BRAF基因突变型的复发率也明显高(22％VS 5％)。故认为检测PTC的BRAF V600E基因突变可辅助预测术后复发风险。Kim等［10］也报道检测原发灶的BRAF V600E基因突变可预测PTC的颈部淋巴结转移，而且其预测价值较患者年龄、肿瘤临床分期、病灶大小等临床病理因素的预测价值高。Elisei等［11］术后随访15年揭示BRAF V600E是预后较差的唯一独立因素。本实验在65例患者当中发现该突变与淋巴结转移没有相关性，这可能与患者数量的有限性和没有长期随访相关。所以本实验在继续随访同时扩大患者数量以获得更准确的数据，为临床医生提供理解和治疗甲状腺乳头状癌的理论依据。
参 考 文 献
［1］ Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. Eur J Immunol,2006, 36(10):2566-2573.
［2］ Anqoulvant D, Clerc A, Benchalal S, et al. Human mesenchymal stem cells suppress induction of cytotoxic response to alloantigens. Biorheoloqy,2004, 41 (324):469-476.
［3］ Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood,2005, 105 (4): 1815-1822.
［4］ Ogawa S, Nitta K, Hara Y, et al. CD 28 knockout mice as a useful clue to exam in the pathogenesis of chronic graft-versus-host reaction. Kidney Int,2000, 58 (5):2215-2220.
［5］ Sithanandam G, Druck T. B-raf and a B-raf pseudogene are located on 7qin man. Oncogene, 1992, 7: 795-799.
［6］ Mercer KE, Pritchard CA. Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as a mutational target. Biochim Biophys Acta,2003, 1653:25-40.
［7］ Knauf JA, Ma X. Targeted expression of BRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice result s in papillary thyroid cancers that transition to undifferentiated carcinomas. The 76th American Thyroid Association Annual meeting, Vancouver, British Columbia, Canada,2004: 45-48.
［8］ Kebebew E，Weng J，Bauer J，et al.The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer.Ann Surg，2007，246(3)：466-471.
［9］ Xing M，Westra W H，Tufano R P，et al.BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer.J Clin Endocfinol Metab，2005,90(12)：6373-6379.
［10］ Kim J，Giuliano A E，Turner R R，et al.Lymphatic mapping establishes the role of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinoma.Ann Surg，2006，244(5)：799-804.
［11］ Elisei R，Ugolini C，Viola D，et al.BRAF(V600E)mutation and outcome of patients with papillary thyroid carcinoma：a 15 year median follow-up study.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(10)：3943-3949.
（收稿日期：2011-08-23）
（本文编辑：车艳）
【关键词】 甲状腺乳头状癌； BRAF； 淋巴结转移
甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中PTC占甲状腺癌的85%~90%。PTC的发生发展涉及到多种基因的突变和重组，例如RET/PTC1, RET/PTC3的重排，NRAS突变和P53突变失活。2002年Davie等［1］报道在66%的恶性黑色素瘤和一系列其它肿瘤中检测到BRAF基因突变,该突变主要见于BRAF基因第11和15外显子的激酶结构域内,80% 以上的突变都是第15外显子位核苷酸上的单碱基颠换,致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。随后在PTC中也检测到了BRAFV600E突变,突变率在28%～83% 之间 ［2~4］。近2年有报道称，BRAFV 600E突变的PTC更容易发生淋巴结转移，但两者之间的确切关系仍需要进一步的研究证明。因此，笔者检测了65例PTC中BRAFV600E突变的突变情况,旨在进一步探讨BRAFV600E突变和PTC淋巴结转移之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究收集了65例PTC患者的手术切除的新鲜组织，由有经验的病理学医生分辨瘤旁的正常组织和肿瘤组织，并立即保存于液氮中。所有病例均由2名以上病理学教授按照世界卫生组织分类标准进行形态学观察，并独立作出诊断。
1.2 方法
1.2.1 DNA 抽提 所有冰冻组织DNA均采用OMEGA DNA 抽提试剂盒提供的方法进行抽提，并采用nanodrop检测DNA的完整性和浓度，所有的DNA的OD值都大于1.9。
1.2.2 引物合成 所需扩增引物均由上海生工生物工程有限公司合成，BRAF-F：ACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCT，BRAF-R：CTGATTTTTGTGAATACTGGGAACT，扩增长度为318 bp。
1.2.3 PCR反应 所用试剂均购于上海申能博彩生物科技有限公司。PCR反应体系为20 L终体积，内含双蒸水13.4 L， 10×PCR buffer（含Mg2+）2 L, dNT 200(mmol/L)0.4 L,上下游引物(10 pmol/L)各1 L, Taq 酶(5 u/L) 0.2 L, 模板2.0 L (约100 ng)。PCR反应条件：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 min, 共35个循环。每一次实验都以双蒸水作为阴性对照。取PCR产物5 L，2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色, 凝胶成像仪下观察并照相。
1.2.4 PCR产物测序 将PCR 产物送往上海博尚生物技术有限公司纯化并测序，测序序列采用PCR前向引物，采用chromos软件进行序列读取，并将测序结果经BLAST基因服务网站进行比对，以确定有无突变。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件, 组间比较用χ2 检验。
2 结果
本次研究收集了65例PTC患者，其中40例患者的肿瘤组织含有BRAFV600E突变（图1），突变率为61.2%，而瘤旁的正常组织均无此突变。40例含有BRAFV600E点突变的患者有14例(35%)发生了淋巴结转移，25例未含有该突变的患者有10例(40%)发生了淋巴结转移，该相关性差异无统计学意义（P=0.7932）（表1）。
3 讨论
不同的研究报导中BRAFV600E在PTC中的突变率不尽相同，从28％～83％不等，主要与不同地域及民族背景等流行病学因素有关。此外，有学者认为可能与PTC的亚型分布有关，经典型PTC、滤泡亚型PTC和甲状腺滤泡状癌（FTC）组织的BRAF V600E突变率分别为51％、24.1％和1.4％。本实验共收集65例PTC患者，突变率为61.5%。Sitham andam［5］和Mercer等［6］证实，BRAF基因为MAPK通路中最强的活化因子,将BRAF突变体转染到NIH3T3细胞内,其转化效率比野生型BRAF增强了70～138倍,从而更加支持BRAF突变可能通过RAS/RAF/MEK/MAPK通路致癌的机制。Knauf等［7］通过诱导转基因鼠甲状腺细胞发生BRAFV600E突变而引发PTC形成的实验也充分说明了这一点。
Kebebw等［8］回顾分析314例分化型甲状腺癌的临床病理资料，报道了典型PTC BRAFV600E基因突变与多种因素有关，包括患者年龄大、有颈部淋巴结或远处转移、临床分期高(Ⅲ～Ⅳ期)，术后有癌组织残留和复发(平均随访6年)。故认为BRAF V600E突变与甲状腺癌的侵袭性表型(aggressive phenotype)有关联，典型PTC中BRAF V600E突变基因型的术后癌组织残留和复发风险高。而多因素分析揭示，只有BRAF V600E突变和颈部淋巴结转移是典型PTC术后复发、转移的独立预后因素。因此，BRAF V600E突变基因型诊断对选择扩大手术切除和减少PTC的术后病灶残留和复发有指导价值。Xing等［9］的219例多中心研究资料揭示，初次手术时癌已侵犯甲状腺周围组织、有颈部淋巴结转移和甲状腺癌已处于进展期(Ⅲ～Ⅳ期)都与PTC的BRAF基因突变有显著相关性。术后随访(平均15个月)揭示BRAF基因突变型(V600E)比野生型PTC的复发率高(25％VS 9％)，即使是Ⅰ～Ⅱ期肿瘤BRAF基因突变型的复发率也明显高(22％VS 5％)。故认为检测PTC的BRAF V600E基因突变可辅助预测术后复发风险。Kim等［10］也报道检测原发灶的BRAF V600E基因突变可预测PTC的颈部淋巴结转移，而且其预测价值较患者年龄、肿瘤临床分期、病灶大小等临床病理因素的预测价值高。Elisei等［11］术后随访15年揭示BRAF V600E是预后较差的唯一独立因素。本实验在65例患者当中发现该突变与淋巴结转移没有相关性，这可能与患者数量的有限性和没有长期随访相关。所以本实验在继续随访同时扩大患者数量以获得更准确的数据，为临床医生提供理解和治疗甲状腺乳头状癌的理论依据。
参 考 文 献
［1］ Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. Eur J Immunol,2006, 36(10):2566-2573.
［2］ Anqoulvant D, Clerc A, Benchalal S, et al. Human mesenchymal stem cells suppress induction of cytotoxic response to alloantigens. Biorheoloqy,2004, 41 (324):469-476.
［3］ Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood,2005, 105 (4): 1815-1822.
［4］ Ogawa S, Nitta K, Hara Y, et al. CD 28 knockout mice as a useful clue to exam in the pathogenesis of chronic graft-versus-host reaction. Kidney Int,2000, 58 (5):2215-2220.
［5］ Sithanandam G, Druck T. B-raf and a B-raf pseudogene are located on 7qin man. Oncogene, 1992, 7: 795-799.
［6］ Mercer KE, Pritchard CA. Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as a mutational target. Biochim Biophys Acta,2003, 1653:25-40.
［7］ Knauf JA, Ma X. Targeted expression of BRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice result s in papillary thyroid cancers that transition to undifferentiated carcinomas. The 76th American Thyroid Association Annual meeting, Vancouver, British Columbia, Canada,2004: 45-48.
［8］ Kebebew E，Weng J，Bauer J，et al.The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer.Ann Surg，2007，246(3)：466-471.
［9］ Xing M，Westra W H，Tufano R P，et al.BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid cancer.J Clin Endocfinol Metab，2005,90(12)：6373-6379.
［10］ Kim J，Giuliano A E，Turner R R，et al.Lymphatic mapping establishes the role of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinoma.Ann Surg，2006，244(5)：799-804.
［11］ Elisei R，Ugolini C，Viola D，et al.BRAF(V600E)mutation and outcome of patients with papillary thyroid carcinoma：a 15 year median follow-up study.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(10)：3943-3949.
（收稿日期：2011-08-23）
（本文编辑：车艳）