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摘要：以东方明珠荷花为试验材料，应用L9（34）正交设计，探讨反应体系中引物、Taq DNA聚合酶等4个不同因素的3个水平对荷花品种反应体系的影响，正交设计所用引物为UBC843，PCR结果应用MINITAB软件进行方差分析和极差分析。结果表明，荷花最佳ISSR-PCR反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2 ，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。優化的ISSR-PCR反应体系稳定性高、重复性较好，为从分子水平对荷花品种进行各项研究奠定了基础。
关键词：荷花；正交设计；ISSR-PCR；体系优化
中图分类号： S188；Q943.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0071-03
荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）为睡莲科莲属植物，是中国传统的十大名花之一，素有“活化石”之称[1]。安龙荷花种质资源丰富，但优良品种较少，在长期自然杂交过程中，不仅形成了类型多样的品种，而且品种间的亲缘关系也较为复杂，给荷花种质资源的收集、保存、研究等带来了不便。传统的形态指标容易受到生态环境及基因显隐性影响，不能客观地估计遗传变异性。因此，从分子水平对荷花品种的亲缘关系和遗传多样性进行研究是非常必要的。1994年Zietkiewicz等创建了简单重复序列间扩增（inter-simple sequence repeat，ISSR）技术[2]，它具有稳定性、可操作性、多态性高等优点[3]，但是ISSR-PCR易受诸多因素如Taq DNA聚合酶、引物、退火温度等干扰，而且不同物种 ISSR-PCR 最佳反应体系的差别也很大[4-5]。正交试验设计可以克服传统单因素试验的不足，考虑各因子的相互作用，具有齐整可比、均衡分散等优点[6]，能通过较少的试验组合快速找到最佳反应体系[7]。黄宇等以6份荷花品种的叶片为材料，采用单因素方法优化ISSR-PCR反应体系[8]；孙祖霞等以荷花品种新红的叶片为材料，采用L16（45）正交设计优化荷花相关序列扩增多态性PCR（SRAP-PCR）反应体系[9]；徐君等也是采用单因素方法优化ISSR-PCR反应体系[10]。迄今为止，关于荷花品种ISSR-PCR反应体系正交优化的报道较少，本研究拟用L9（34）正交设计优化反应体系，以期为后续研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试材料为东方明珠，其花瓣采于贵州省安龙县招堤荷花池，花瓣采集后用硅胶干燥，正交设计过程中用到的引物为UBC 843（CT）8RA。
1.2 DNA的提取
东方明珠花瓣DNA的提取参考桂腾琴等方法[11]；DNA纯度、浓度用UV-4501S紫外分光光度计测定；DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3 正交试验设计
采用L9（34）正交设计，各因素-水平组合见表1。每个处理重复2次，反应总体积为25 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50.6 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 7 min，扩增结束后于4 ℃保存。PCR扩增产物用1.4 %琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色电泳后，在Bio-RAD凝胶成像系统中进行观察和分析。
1.4 退火温度的确定
设定6 个退火温度：47.6、48.6、49.6、50.6、51.6、53.6 ℃，选用正交设计确定的最佳反应体系对引物UBC 843（CT）8RA退火温度进行筛选试验，其余参数不变。
2 结果与分析
2.1 正交设计分析
计分参照何正文等方法[12]，根据条带的多少、特异性与清晰程度依次打分：条带多而亮、清晰，记9分；最低分记1分；2次重复独立计分。9个组合的分数（2次重复）依次为：3、3；8、7；4、6；9、9；6、5；7、1；1、4；5、8；2、2。由图1可见：第7号、第9号、第6’号、第9’号处理效果较差，背景深、条带少，且条带不整齐；第4号处理最好，2次重复扩增条带比较稳定，条带多且清晰。
2.2 各因素不同水平对PCR的影响
为确定最佳的PCR反应体系，需要对各因素不同水平进行多重比较。极差的大小表明该因素对PCR扩增影响的强弱。由表2可以看出：引物浓度对PCR扩增的影响最强，其次是TaqDNA聚合酶，影响最弱的是dNTPs。正交试验扩增的结果用MINITAB软件进行方差分析，由表3可知：方差分析与极差分析的结果比较一致；引物不同水平间差异在方差分析中达到显著水平（P<0.05），其余因素在水平间差异不显著。
2.2.1 Taq DNA聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响 由表2可知，Taq DNA聚合酶浓度在该试验中是影响PCR扩增的次要因素。由图2可以看出：Taq DNA聚合酶在 1.00 U/25 μL 水平差异明显，而在0.75 U/25 μL（1、4、7号处理）、1.50 U/25 μL（3、6、9号处理）2个水平差异不明显；Taq 酶量为1.00 U/25 μL（2、5、8号处理）扩增的条带清晰，条带丰富。综合结果可知，1.00 U/25 μL为Taq酶最佳浓度，与刘艺平等的研究结果[13-14]一致。
2.2.2 Mg2 浓度对PCR扩增结果的影响 图2显示：Mg2 浓度3个水平对PCR扩增影响不明显，Mg2 浓度为 2.0 mmol/L 时均分最大；Mg2 浓度为2.5 mmol/L时，均分呈下降趋势。最终确定Mg2 的最佳浓度为2.0 mmol/L。
2.2.3 dNTPs浓度对PCR扩增结果的影响 从图2可以看出：dNTPs浓度为0.15 mmol/L（1、6、8号处理）、0.25 mmol/L（3、5、7号处理）时，扩增条带少且不稳定；dNTPs 浓度为 0.20 mmol/L 时，PCR扩增均分最高，确定其为最佳dNTPs 浓度。 2.2.4 引物浓度对PCR扩增结果的影响 本试验中影响PCR扩增的主要因素是引物浓度（表2）。引物浓度为0.20、0.30 μmol/L时，均值差异不明显；当浓度为0.40 μmol/L（3、4、8号处理）时，均值达到最大（图2）。因此，选择引物最佳浓度为0.40 μmol/L，与李立升等研究结果[15-16]相同。
2.3 PCR扩增退火温度的确定
ISSR引物退火温度对PCR扩增结果影响很大。由图3可见：当退火温度为47.6、48.6、49.6 ℃时，扩增不稳定且条带少；当退火温度为50.6、51.6 ℃时，扩增条带清晰且数量多、稳定。可见，在ISSR-PCR擴增中适当提高退火温度可
以增加特异性条带，因此引物UBC 843的最适退火温度为51.6 ℃。
2.4 最优体系的确定和稳定性验证
综上所述，荷花品种最佳ISSR-PCR反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2 ，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。利用引物UBC 827在退火温度为51.6 ℃的条件下进行体系稳定性检测，图4表明：体系稳定、效果好，可用于荷花品种亲缘关系和遗传多样性的研究。
3 讨论与结论
正交设计可以克服传统的单因素试验和完全组合设计不足，从复因子试验中挑选出有代表性的水平组合进行试验，节约了成本、时间，具有齐整可比、均衡分散等优点[6，17]。但是对正交设计扩增结果进行直观分析有一定的主观性和随意性[18-19]，要么可以适当增加试验重复次数，从而增加对PCR扩增的评判次数，来减少打分误差，使试验数据更可靠[4]，要么也可以借助分析软件对结果进行分析。
PCR扩增结果受物种[4-5，7]、扩增程序、多因子等综合影响，退火温度很小的变动就会引起扩增结果很大的变化。本试验中各因素对PCR扩增的影响由强到弱为：引物浓度﹥Taq DNA聚合酶浓度﹥Mg2 浓度﹥dNTPs浓度，结果与任风鸣等的研究结果[20]相似。而梨的正交试验[21]和李伟等对锁阳的ISSR-PCR优化研究[5]认为，对PCR影响最关键的是Taq DNA聚合酶，其次是引物浓度。孙清信等研究表明，模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增影响最小[22-23]，对荷花品种模板DNA浓度进行单因素优化时也得到相似的结果，模板DNA浓度在20～80 ng/25 μL均能扩增出条带，且条带清晰；但是如果模板DNA不纯，则导致扩增条带少或无扩增条带[21，24]。出现这些差异要么与物种、引物特异性有关，要么与主观评价有关。因此，为了更好地将正交设计广泛应用于研究中，既可以建立客观的评判标准，也可以提高分析结果的可信度。
综合考虑后得出荷花品种最佳反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2 ，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。该反应体系在其他引物中扩增获得了清晰的条带，为后续研究奠定了坚实基础。
参考文献：
[1]张行言. 中国荷花新品种图志I[M]. 北京：中国林业出版社，2011：1-2.
[2]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.
[3]Syamkumar S，Sasikumar B. Molecular marker based genetic diversity analysis of Curcuma species from India[J]. Scientia Horticulturae，2007，112（2）：235-241.
[4]唐 辉，陈宗游，史艳财，等. 正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系[J]. 中草药，2013，44（5）：610-615.
[5]李 伟，刘广达，陈 青，等. 锁阳ISSR-PCR反应体系的优化研究[J]. 生物技术通报，2012（8）：135-140.
[6]明道绪. 生物统计附试验设计[M]. 3版.北京：中国农业出版社，2007：286-287.
[7]王 军，杨荣萍，洪明伟，等. 石榴SPAR-PCR反应体系的正交设计优化及验证[J]. 云南农业大学学报，2013，28（3）：376-379.
[8]黄 宇，何天友，荣俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 亚热带农业研究，2009，5（4）：284-288.
[9]孙祖霞，刘兆磊，陈素梅，等. 荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立[J]. 南京农业大学学报，2011，34（6）：53-58.
[10]徐 君，李静会，李 欣，等. 荷花ISSR引物筛选及反应体系优化[J]. 江苏农业科学，2014，42（10）：42-44.
[11]桂腾琴，乔爱民，孙 敏，等. 果梅基因组DNA提取方法的比较及ISSR分析[J]. 北方园艺，2008（4）： 212-215.
[12]何正文，刘运生，陈立华，等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报，1998，23（4）：76-77.
[13]刘艺平，李 创，李 娜，等. 荷花遗传多样性的ISSR标记分析[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2013，41（4）：139-146.
[14]孔德政. 荷花的民族植物学及河南地区品种资源研究[D]. 郑州：河南农业大学，2011：100-101.
[15]李立升. 21个荷花品种遗传多样性的ISSR分析[D]. 郑州：河南农业大学，2011：20-20.
[16]刁松锋，邵文豪，姜景民，等. 多用途树种无患子 ISSR-PCR 体系建立与检测[J]. 广西植物，2015，35（6）：899-904.
[17]桂腾琴，孙 敏，乔爱民. 正交设计优化果梅ISSR反应体系[J]. 果树学报，2009，26（1）：108-112.
[18]王彦华，侯喜林，徐明宇. 正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究[J]. 西北植物学报，2004，24（5）：899-902.
[19]谢运海，夏德安，姜 静，等. 利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系[J]. 分子植物育种，2005，3（3）：445-450.
[20]任风鸣，胡开治，刘燕琴，等. 传统中药金钱草ISSR-PCR反应体系的正交优化研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（12）：2233-2238.
[21]桂腾琴，孙 敏，陆春连，等. 梨ISSR-PCR反应体系的正交优化研究[J]. 西南师范大学学报：自然科学版，2014，39（12）：37-42.
[22]孙清信，陈 坚，张 辉，等. 紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（5）：870-878.
[23]姜 静，杨传平，刘桂丰，等. 桦树ISSR-PCR反应体系的优化[J]. 生态学杂志，2003，22（3）：91-93.
[24]范海艳，曹福祥，彭继庆，等. 博白大果油茶ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 中南林业科技大学学报，2011，31（4）：97-103.
关键词：荷花；正交设计；ISSR-PCR；体系优化
中图分类号： S188；Q943.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0071-03
荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）为睡莲科莲属植物，是中国传统的十大名花之一，素有“活化石”之称[1]。安龙荷花种质资源丰富，但优良品种较少，在长期自然杂交过程中，不仅形成了类型多样的品种，而且品种间的亲缘关系也较为复杂，给荷花种质资源的收集、保存、研究等带来了不便。传统的形态指标容易受到生态环境及基因显隐性影响，不能客观地估计遗传变异性。因此，从分子水平对荷花品种的亲缘关系和遗传多样性进行研究是非常必要的。1994年Zietkiewicz等创建了简单重复序列间扩增（inter-simple sequence repeat，ISSR）技术[2]，它具有稳定性、可操作性、多态性高等优点[3]，但是ISSR-PCR易受诸多因素如Taq DNA聚合酶、引物、退火温度等干扰，而且不同物种 ISSR-PCR 最佳反应体系的差别也很大[4-5]。正交试验设计可以克服传统单因素试验的不足，考虑各因子的相互作用，具有齐整可比、均衡分散等优点[6]，能通过较少的试验组合快速找到最佳反应体系[7]。黄宇等以6份荷花品种的叶片为材料，采用单因素方法优化ISSR-PCR反应体系[8]；孙祖霞等以荷花品种新红的叶片为材料，采用L16（45）正交设计优化荷花相关序列扩增多态性PCR（SRAP-PCR）反应体系[9]；徐君等也是采用单因素方法优化ISSR-PCR反应体系[10]。迄今为止，关于荷花品种ISSR-PCR反应体系正交优化的报道较少，本研究拟用L9（34）正交设计优化反应体系，以期为后续研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试材料为东方明珠，其花瓣采于贵州省安龙县招堤荷花池，花瓣采集后用硅胶干燥，正交设计过程中用到的引物为UBC 843（CT）8RA。
1.2 DNA的提取
东方明珠花瓣DNA的提取参考桂腾琴等方法[11]；DNA纯度、浓度用UV-4501S紫外分光光度计测定；DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3 正交试验设计
采用L9（34）正交设计，各因素-水平组合见表1。每个处理重复2次，反应总体积为25 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50.6 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 7 min，扩增结束后于4 ℃保存。PCR扩增产物用1.4 %琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色电泳后，在Bio-RAD凝胶成像系统中进行观察和分析。
1.4 退火温度的确定
设定6 个退火温度：47.6、48.6、49.6、50.6、51.6、53.6 ℃，选用正交设计确定的最佳反应体系对引物UBC 843（CT）8RA退火温度进行筛选试验，其余参数不变。
2 结果与分析
2.1 正交设计分析
计分参照何正文等方法[12]，根据条带的多少、特异性与清晰程度依次打分：条带多而亮、清晰，记9分；最低分记1分；2次重复独立计分。9个组合的分数（2次重复）依次为：3、3；8、7；4、6；9、9；6、5；7、1；1、4；5、8；2、2。由图1可见：第7号、第9号、第6’号、第9’号处理效果较差，背景深、条带少，且条带不整齐；第4号处理最好，2次重复扩增条带比较稳定，条带多且清晰。
2.2 各因素不同水平对PCR的影响
为确定最佳的PCR反应体系，需要对各因素不同水平进行多重比较。极差的大小表明该因素对PCR扩增影响的强弱。由表2可以看出：引物浓度对PCR扩增的影响最强，其次是TaqDNA聚合酶，影响最弱的是dNTPs。正交试验扩增的结果用MINITAB软件进行方差分析，由表3可知：方差分析与极差分析的结果比较一致；引物不同水平间差异在方差分析中达到显著水平（P<0.05），其余因素在水平间差异不显著。
2.2.1 Taq DNA聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响 由表2可知，Taq DNA聚合酶浓度在该试验中是影响PCR扩增的次要因素。由图2可以看出：Taq DNA聚合酶在 1.00 U/25 μL 水平差异明显，而在0.75 U/25 μL（1、4、7号处理）、1.50 U/25 μL（3、6、9号处理）2个水平差异不明显；Taq 酶量为1.00 U/25 μL（2、5、8号处理）扩增的条带清晰，条带丰富。综合结果可知，1.00 U/25 μL为Taq酶最佳浓度，与刘艺平等的研究结果[13-14]一致。
2.2.2 Mg2 浓度对PCR扩增结果的影响 图2显示：Mg2 浓度3个水平对PCR扩增影响不明显，Mg2 浓度为 2.0 mmol/L 时均分最大；Mg2 浓度为2.5 mmol/L时，均分呈下降趋势。最终确定Mg2 的最佳浓度为2.0 mmol/L。
2.2.3 dNTPs浓度对PCR扩增结果的影响 从图2可以看出：dNTPs浓度为0.15 mmol/L（1、6、8号处理）、0.25 mmol/L（3、5、7号处理）时，扩增条带少且不稳定；dNTPs 浓度为 0.20 mmol/L 时，PCR扩增均分最高，确定其为最佳dNTPs 浓度。 2.2.4 引物浓度对PCR扩增结果的影响 本试验中影响PCR扩增的主要因素是引物浓度（表2）。引物浓度为0.20、0.30 μmol/L时，均值差异不明显；当浓度为0.40 μmol/L（3、4、8号处理）时，均值达到最大（图2）。因此，选择引物最佳浓度为0.40 μmol/L，与李立升等研究结果[15-16]相同。
2.3 PCR扩增退火温度的确定
ISSR引物退火温度对PCR扩增结果影响很大。由图3可见：当退火温度为47.6、48.6、49.6 ℃时，扩增不稳定且条带少；当退火温度为50.6、51.6 ℃时，扩增条带清晰且数量多、稳定。可见，在ISSR-PCR擴增中适当提高退火温度可
以增加特异性条带，因此引物UBC 843的最适退火温度为51.6 ℃。
2.4 最优体系的确定和稳定性验证
综上所述，荷花品种最佳ISSR-PCR反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2 ，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。利用引物UBC 827在退火温度为51.6 ℃的条件下进行体系稳定性检测，图4表明：体系稳定、效果好，可用于荷花品种亲缘关系和遗传多样性的研究。
3 讨论与结论
正交设计可以克服传统的单因素试验和完全组合设计不足，从复因子试验中挑选出有代表性的水平组合进行试验，节约了成本、时间，具有齐整可比、均衡分散等优点[6，17]。但是对正交设计扩增结果进行直观分析有一定的主观性和随意性[18-19]，要么可以适当增加试验重复次数，从而增加对PCR扩增的评判次数，来减少打分误差，使试验数据更可靠[4]，要么也可以借助分析软件对结果进行分析。
PCR扩增结果受物种[4-5，7]、扩增程序、多因子等综合影响，退火温度很小的变动就会引起扩增结果很大的变化。本试验中各因素对PCR扩增的影响由强到弱为：引物浓度﹥Taq DNA聚合酶浓度﹥Mg2 浓度﹥dNTPs浓度，结果与任风鸣等的研究结果[20]相似。而梨的正交试验[21]和李伟等对锁阳的ISSR-PCR优化研究[5]认为，对PCR影响最关键的是Taq DNA聚合酶，其次是引物浓度。孙清信等研究表明，模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增影响最小[22-23]，对荷花品种模板DNA浓度进行单因素优化时也得到相似的结果，模板DNA浓度在20～80 ng/25 μL均能扩增出条带，且条带清晰；但是如果模板DNA不纯，则导致扩增条带少或无扩增条带[21，24]。出现这些差异要么与物种、引物特异性有关，要么与主观评价有关。因此，为了更好地将正交设计广泛应用于研究中，既可以建立客观的评判标准，也可以提高分析结果的可信度。
综合考虑后得出荷花品种最佳反应体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2 ，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。该反应体系在其他引物中扩增获得了清晰的条带，为后续研究奠定了坚实基础。
参考文献：
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[10]徐 君，李静会，李 欣，等. 荷花ISSR引物筛选及反应体系优化[J]. 江苏农业科学，2014，42（10）：42-44.
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[12]何正文，刘运生，陈立华，等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报，1998，23（4）：76-77.
[13]刘艺平，李 创，李 娜，等. 荷花遗传多样性的ISSR标记分析[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2013，41（4）：139-146.
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