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摘要[目的]采用响应面法研究具有根瘤菌保护作用的蛋白类、盐类、糖类和微量元素类物质。[方法]通过设置不同种类、组合、配比、浓度的大豆根瘤菌保护剂配方，在实验室中模拟实际应用条件，研究具有提高根瘤菌存活率和存活时间作用的液体保护剂配方。采用响应面法的中心组合试验确定各显著因子的最佳水平。[结果]筛选出各类化合物中影响有效活菌数的显著因子，即蛋白胨、黄原胶、NaCl优化后的各类化合物的终浓度如下：蛋白胨0.13%，黄原胶0.011%，氯化钠0.30%。[结论]菌株HW05在加入保护剂室温放置180 d后的有效活菌数为3.185×108 CFU/mL，与未加入保护剂优化前（2.458×108 CFU/mL）相比存活率提高了25%以上。
关键词大豆根瘤菌；保护剂配方；优化；响应面法
中图分类号S501；Q781文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-003-03
ZHEN Tao1， CHEN Wei2， SHA Changqing2， YU Deshui1，3* et al（1. Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150010； 2. Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150000； 3. Institute of Advanced Technology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150020）
Abstract[Objective] The response surface methodology was used to study the protective effect of proteins， salts， sugars and trace elements on Rhizobium. [Method] Through setting up different types， combinations， ratios and concentrations of Rhizobium protective agent formulation， simulating actual conditions in laboratory， liquid protective agent formulation with effect of improving survival rate and time of Rhizobium was studied. The optimal level of each significant factor was determined by using central composite experiment of response surface methodology. [Result] The significant factors influencing the number of effective viable bacteria in compounds were obtained， namely peptone， xanthan gum and NaCl； The optimized final concentrations of compounds were： peptone 0.13%， xanthan gum 0.011% and NaCl 0.30%. [Conclusion] The effective viable count of HW-05 strain is 3.185 × 108 CFU/mL after addition of protective agent at room temperature for 180 d， compared with the previous （2.458 × 108 CFU/mL） protective agent is not added， the survival rate is increased by more than 25%.
Key wordsRhizobium； Protective agent formulation； Optimization； Response surface methodology
目前，该区域内大豆种植面积在133.33万hm2以上，年产量在200万t以上。但是，目前关于根瘤菌剂的应用报道还很少，仅占播种面积的2%左右，根瘤菌剂的应用前景广阔[3]。保护剂配方中既有维持微生物渗透压的盐类、糖类物质，又有刺激菌剂和大豆生长的蛋白质和微量元素，还有能够有效成膜、促进根瘤菌在大豆表面形成比较优势的蛋白类物质，在实际应用中会形成占位优势，抵抗土著根瘤菌的侵染，增加有效结瘤数量，提高接种根瘤菌剂的使用效果。针对大豆根瘤菌的有效活菌数随时间的延长而不断下降的问题，笔者采用响应面法对大豆根瘤菌HW05的保护剂配方进行优化。
筛选出合适的保护剂配方，与根瘤菌劑配伍使用，可以提高根瘤菌剂在土壤中的存活率[4]，能在大豆种子表面形成比较优势，抵抗土著根瘤菌的竞争，减少无效结瘤数。笔者采用响应面法对大豆根瘤菌HW05的保护剂配方进行优化，以期为实现大豆根瘤菌剂的大面积推广与应用，提高黑龙江省大豆产量和品质奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌种慢生型大豆根瘤菌HW05，由黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心保存。
1.2培养基YM培养基：磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.1 g，酵母提取物0.4 g，甘露醇10 g，pH 7.0，蒸馏水1 000 mL。上述培养基的灭菌条件均为湿热灭菌：121 ℃，20 min，初始pH为6.8～7.0。 1.3培养方法
1.3.1种子活化。取-80 ℃下保存的环根瘤菌HW05，接种到装入5 mL YM液体培养基的试管中，于28 ℃下180 r/min培养3 d。用接种环将HW05菌液划线接种到YMA平板上，28 ℃下置于恒溫培养箱中，倒置静止培养7 d左右，直至出现单菌落为止。然后，再挑取单菌落接种到YM液体培养基中，28 ℃180 r/min培养3 d，备用。
1.3.2发酵培养。挑取一环新鲜的平板种子接种于250 mL的三角瓶中，装液量为30 mL，28 ℃180 r/min振荡培养3 d后，按2%的接种量接种于500 mL的三角瓶中，装液量为100 mL，28 ℃180 r/min振荡培养3 d后分装到试管中，每支试管内分装10 mL。
1.4活菌计数采用平板菌落计数法进行活菌计数。取100 μL HW05菌液样品，加入装有900 μL无菌水的离心管中，即为10-1稀释液，再用200 μL移液枪吸取10-1稀释液100 μL移入装有900 μL无菌水的离心管中，即为10-2稀释液，以此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度的菌液，供平板计数使用。分别涂布平板，28 ℃下培养7 d后计数。
1.5筛选显著因子采用不同种类、不同配比进行单因素、2因素、3因素试验，对蛋白类、盐类和糖类3大类（6种化合物），即牛血清蛋白、蛋白胨、黄原胶、羧甲基纤维素钠、NaCl、KCl进行全面考察。选择6因素6水平的试验设计，每个因素取6个水平，使水平呈梯度变化，检测各梯度下的有效活菌数，从而确定最大响应面值的区域，筛选出显著因子及最佳终浓度，最终筛选组合获得效果较好的配方。筛选几种不同种化合物中的显著因子，对牛血清蛋白、蛋白胨、黄原胶、羧甲基纤维素钠、NaCl和KCl进行考察，选择6因素6水平的试验设计（表 1）。
1.6响应面分析筛选显著因子确定了影响HW05菌株有效活菌数的3个主要因子，确定了3个主要因子响应区域的中心点，采用BoxBehnken的中心组合设计原理在主要因子的响应区各取3个水平，设计3因素3水平的响应面分析试验[5-6]。
1.7数据处理每个处理包含3个平行试验，取均值。采用Minitab 16 软件完成，BoxBehnken设计的响应面分析由DesignExpert 8.0完成[7]。
2结果与分析
2.1筛选显著因子单因素试验是同一批次进行的，因此每个因子的对照都是相同的，对照1为在室温放置180 d后的未添加化合物HW05的活菌数为2.429×108 CFU/mL；对照2为新鲜培养基对数期的活菌数为4.235×109 CFU/mL。牛血清蛋白在终浓度为0.05%时活菌数最高（2.311×108 CFU/mL），蛋白胨在终浓度为0.1%时活菌数最高，为2331×108 CFU/mL。黄原胶在终浓度为0.01%时活菌数最高（1.910×108 CFU/mL），羧甲基纤维素钠在终浓度为0.01%时活菌数最高（2.219×108 CFU/mL）。NaCl在终浓度为0.30%时活菌数最高（2.311×108 CFU/mL），KCl在终浓度为0.15%时活菌数最高（2.086×108 CFU/mL）。2因素试验中蛋白胨+黄原胶的活菌数为2.530×108 CFU/mL，牛血清蛋白+黄原胶为2.465×108 CFU/mL。黄原胶+ NaCl为2.72×108 CFU/mL个，牛血清蛋白+NaCl为2.435×108 CFU/mL，蛋白胨+ KCl为2.530×108 CFU/mL。3因素试验中蛋白胨+黄原胶+ NaCl的活菌数最高（3.242×108 CFU/mL），蛋白胨+黄原胶+ KCl为3.203×108 CFU/mL。由此可以确定蛋白胨、黄原胶、NaCl是显著因子。
对3个组分进行分析，各组分分别取高低2个水平（1和-1）见表2。
2.2响应面试验分析确定了显著因子的最适浓度区域，以蛋白胨0.1%、黄原胶0.01%和NaCl 0.30%的终浓度为中心点进行响应面分析试验，各因素代码和水平设计见表3。
3个因素
方差分析表明，Prob>F小于0.050 0的值表示模型项显著，大于0.100 0表明模型项不显著。该模型的一次项中的A，二次项中的A2、B2以及交互作用的AB对有效活菌数的影响都是显著的；回归模型的P值为0.023 9，表明模型是显著的，而失拟项的P值为0.080 9，失拟不显著；模型的决定系数R2=0.863 2，说明模型达到较好的拟合程度。经分析软件回归拟合得到该模型的回归方程：R1=6.33+0.059A+0.035B-0.040C+0.088AB+0.022AC+0.010BC-0080A2-0.097B2-0.062C2。
为求解该回归方程的极值点，对其各自变量分别求一阶偏导，得到三元一次方程组，求解出该模型的极值点，从而计算出对应因素值：蛋白胨0.13%、黄原胶0.011%、NaCl 030%，此时模型的理论最优有效活菌数为3.180×108 CFU/mL。
3结论
笔者从3种化合物中筛选出3个显著因子：蛋白胨、黄原胶和NaCl，采用响应面分析法的BoxBehnken设计确定显著因子的最优配比，最终确定了HW05保护剂中各物质的终浓度分别为：蛋白胨0.13%、黄原胶0.011%、NaCl 0.30%，经验证试验检测结果为3.185×108 CFU/mL，与预测值相近，说明了该模型拟合的有效性。常温条件下放置180 d后根瘤菌剂的存活率，对照活菌数为2.458×108 CFU/mL，经保护剂作用后4个配方的活菌数都在3.1×108 CFU/mL以上，存活率与对照相比提高25%以上，说明经筛选后的保护剂配方可以有效提高根瘤菌的存活率。
参考文献
[1] 李艳杰.接种大豆根瘤菌对大豆生长及产量的影响[J].黑龙江农业科学，2013（1）：50-52.
[2] 魏鲁玉.大豆根瘤菌的使用技术[J].大豆科技，2012（2）：61-62.
[3] 吴云汉.大豆根瘤菌菌株接种效果的研究[J].河南农业大学学报，1996（1）：99-101.
[4] 李勇昊，周长海，丁雷，等.发酵培养基优化策略[J].北京联合大学学报（自然科学版），2011（2）：53-59.
[5] 刘志祥，曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺，2009（2）：127-129.
[6] 王永宏，张强，张兴.响应面法优化Xenorhabdus nematophila发酵培养基的研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2009（7）：140-146.
[7] 吴萍，李正鹏，何庆元，等.大豆根瘤菌AHM2B菌株培养条件的筛选与优化[J].大豆科学，2014（6）：953-956.
[8] 张广臣，雷虹，何欣，等.微生物发酵培养基优化中的现代数学统计学方法[J].食品与发酵工业，2010（5）：110-113.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2016，44（10）：9-12
责任编辑乔利利
关键词大豆根瘤菌；保护剂配方；优化；响应面法
中图分类号S501；Q781文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-003-03
ZHEN Tao1， CHEN Wei2， SHA Changqing2， YU Deshui1，3* et al（1. Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150010； 2. Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150000； 3. Institute of Advanced Technology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150020）
Abstract[Objective] The response surface methodology was used to study the protective effect of proteins， salts， sugars and trace elements on Rhizobium. [Method] Through setting up different types， combinations， ratios and concentrations of Rhizobium protective agent formulation， simulating actual conditions in laboratory， liquid protective agent formulation with effect of improving survival rate and time of Rhizobium was studied. The optimal level of each significant factor was determined by using central composite experiment of response surface methodology. [Result] The significant factors influencing the number of effective viable bacteria in compounds were obtained， namely peptone， xanthan gum and NaCl； The optimized final concentrations of compounds were： peptone 0.13%， xanthan gum 0.011% and NaCl 0.30%. [Conclusion] The effective viable count of HW-05 strain is 3.185 × 108 CFU/mL after addition of protective agent at room temperature for 180 d， compared with the previous （2.458 × 108 CFU/mL） protective agent is not added， the survival rate is increased by more than 25%.
Key wordsRhizobium； Protective agent formulation； Optimization； Response surface methodology
目前，该区域内大豆种植面积在133.33万hm2以上，年产量在200万t以上。但是，目前关于根瘤菌剂的应用报道还很少，仅占播种面积的2%左右，根瘤菌剂的应用前景广阔[3]。保护剂配方中既有维持微生物渗透压的盐类、糖类物质，又有刺激菌剂和大豆生长的蛋白质和微量元素，还有能够有效成膜、促进根瘤菌在大豆表面形成比较优势的蛋白类物质，在实际应用中会形成占位优势，抵抗土著根瘤菌的侵染，增加有效结瘤数量，提高接种根瘤菌剂的使用效果。针对大豆根瘤菌的有效活菌数随时间的延长而不断下降的问题，笔者采用响应面法对大豆根瘤菌HW05的保护剂配方进行优化。
筛选出合适的保护剂配方，与根瘤菌劑配伍使用，可以提高根瘤菌剂在土壤中的存活率[4]，能在大豆种子表面形成比较优势，抵抗土著根瘤菌的竞争，减少无效结瘤数。笔者采用响应面法对大豆根瘤菌HW05的保护剂配方进行优化，以期为实现大豆根瘤菌剂的大面积推广与应用，提高黑龙江省大豆产量和品质奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌种慢生型大豆根瘤菌HW05，由黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心保存。
1.2培养基YM培养基：磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.1 g，酵母提取物0.4 g，甘露醇10 g，pH 7.0，蒸馏水1 000 mL。上述培养基的灭菌条件均为湿热灭菌：121 ℃，20 min，初始pH为6.8～7.0。 1.3培养方法
1.3.1种子活化。取-80 ℃下保存的环根瘤菌HW05，接种到装入5 mL YM液体培养基的试管中，于28 ℃下180 r/min培养3 d。用接种环将HW05菌液划线接种到YMA平板上，28 ℃下置于恒溫培养箱中，倒置静止培养7 d左右，直至出现单菌落为止。然后，再挑取单菌落接种到YM液体培养基中，28 ℃180 r/min培养3 d，备用。
1.3.2发酵培养。挑取一环新鲜的平板种子接种于250 mL的三角瓶中，装液量为30 mL，28 ℃180 r/min振荡培养3 d后，按2%的接种量接种于500 mL的三角瓶中，装液量为100 mL，28 ℃180 r/min振荡培养3 d后分装到试管中，每支试管内分装10 mL。
1.4活菌计数采用平板菌落计数法进行活菌计数。取100 μL HW05菌液样品，加入装有900 μL无菌水的离心管中，即为10-1稀释液，再用200 μL移液枪吸取10-1稀释液100 μL移入装有900 μL无菌水的离心管中，即为10-2稀释液，以此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度的菌液，供平板计数使用。分别涂布平板，28 ℃下培养7 d后计数。
1.5筛选显著因子采用不同种类、不同配比进行单因素、2因素、3因素试验，对蛋白类、盐类和糖类3大类（6种化合物），即牛血清蛋白、蛋白胨、黄原胶、羧甲基纤维素钠、NaCl、KCl进行全面考察。选择6因素6水平的试验设计，每个因素取6个水平，使水平呈梯度变化，检测各梯度下的有效活菌数，从而确定最大响应面值的区域，筛选出显著因子及最佳终浓度，最终筛选组合获得效果较好的配方。筛选几种不同种化合物中的显著因子，对牛血清蛋白、蛋白胨、黄原胶、羧甲基纤维素钠、NaCl和KCl进行考察，选择6因素6水平的试验设计（表 1）。
1.6响应面分析筛选显著因子确定了影响HW05菌株有效活菌数的3个主要因子，确定了3个主要因子响应区域的中心点，采用BoxBehnken的中心组合设计原理在主要因子的响应区各取3个水平，设计3因素3水平的响应面分析试验[5-6]。
1.7数据处理每个处理包含3个平行试验，取均值。采用Minitab 16 软件完成，BoxBehnken设计的响应面分析由DesignExpert 8.0完成[7]。
2结果与分析
2.1筛选显著因子单因素试验是同一批次进行的，因此每个因子的对照都是相同的，对照1为在室温放置180 d后的未添加化合物HW05的活菌数为2.429×108 CFU/mL；对照2为新鲜培养基对数期的活菌数为4.235×109 CFU/mL。牛血清蛋白在终浓度为0.05%时活菌数最高（2.311×108 CFU/mL），蛋白胨在终浓度为0.1%时活菌数最高，为2331×108 CFU/mL。黄原胶在终浓度为0.01%时活菌数最高（1.910×108 CFU/mL），羧甲基纤维素钠在终浓度为0.01%时活菌数最高（2.219×108 CFU/mL）。NaCl在终浓度为0.30%时活菌数最高（2.311×108 CFU/mL），KCl在终浓度为0.15%时活菌数最高（2.086×108 CFU/mL）。2因素试验中蛋白胨+黄原胶的活菌数为2.530×108 CFU/mL，牛血清蛋白+黄原胶为2.465×108 CFU/mL。黄原胶+ NaCl为2.72×108 CFU/mL个，牛血清蛋白+NaCl为2.435×108 CFU/mL，蛋白胨+ KCl为2.530×108 CFU/mL。3因素试验中蛋白胨+黄原胶+ NaCl的活菌数最高（3.242×108 CFU/mL），蛋白胨+黄原胶+ KCl为3.203×108 CFU/mL。由此可以确定蛋白胨、黄原胶、NaCl是显著因子。
对3个组分进行分析，各组分分别取高低2个水平（1和-1）见表2。
2.2响应面试验分析确定了显著因子的最适浓度区域，以蛋白胨0.1%、黄原胶0.01%和NaCl 0.30%的终浓度为中心点进行响应面分析试验，各因素代码和水平设计见表3。
3个因素
方差分析表明，Prob>F小于0.050 0的值表示模型项显著，大于0.100 0表明模型项不显著。该模型的一次项中的A，二次项中的A2、B2以及交互作用的AB对有效活菌数的影响都是显著的；回归模型的P值为0.023 9，表明模型是显著的，而失拟项的P值为0.080 9，失拟不显著；模型的决定系数R2=0.863 2，说明模型达到较好的拟合程度。经分析软件回归拟合得到该模型的回归方程：R1=6.33+0.059A+0.035B-0.040C+0.088AB+0.022AC+0.010BC-0080A2-0.097B2-0.062C2。
为求解该回归方程的极值点，对其各自变量分别求一阶偏导，得到三元一次方程组，求解出该模型的极值点，从而计算出对应因素值：蛋白胨0.13%、黄原胶0.011%、NaCl 030%，此时模型的理论最优有效活菌数为3.180×108 CFU/mL。
3结论
笔者从3种化合物中筛选出3个显著因子：蛋白胨、黄原胶和NaCl，采用响应面分析法的BoxBehnken设计确定显著因子的最优配比，最终确定了HW05保护剂中各物质的终浓度分别为：蛋白胨0.13%、黄原胶0.011%、NaCl 0.30%，经验证试验检测结果为3.185×108 CFU/mL，与预测值相近，说明了该模型拟合的有效性。常温条件下放置180 d后根瘤菌剂的存活率，对照活菌数为2.458×108 CFU/mL，经保护剂作用后4个配方的活菌数都在3.1×108 CFU/mL以上，存活率与对照相比提高25%以上，说明经筛选后的保护剂配方可以有效提高根瘤菌的存活率。
参考文献
[1] 李艳杰.接种大豆根瘤菌对大豆生长及产量的影响[J].黑龙江农业科学，2013（1）：50-52.
[2] 魏鲁玉.大豆根瘤菌的使用技术[J].大豆科技，2012（2）：61-62.
[3] 吴云汉.大豆根瘤菌菌株接种效果的研究[J].河南农业大学学报，1996（1）：99-101.
[4] 李勇昊，周长海，丁雷，等.发酵培养基优化策略[J].北京联合大学学报（自然科学版），2011（2）：53-59.
[5] 刘志祥，曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺，2009（2）：127-129.
[6] 王永宏，张强，张兴.响应面法优化Xenorhabdus nematophila发酵培养基的研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2009（7）：140-146.
[7] 吴萍，李正鹏，何庆元，等.大豆根瘤菌AHM2B菌株培养条件的筛选与优化[J].大豆科学，2014（6）：953-956.
[8] 张广臣，雷虹，何欣，等.微生物发酵培养基优化中的现代数学统计学方法[J].食品与发酵工业，2010（5）：110-113.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2016，44（10）：9-12
责任编辑乔利利