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[摘要]目的：比较点阵CO2激光和Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）对老化昆明小鼠真皮重塑的作用，并探讨二者嫩肤作用机制，为临床选择治疗方法提供理论依据。方法：应用两种波长激光照射自然老化昆明小鼠背部脱毛皮肤，通过HE染色进行成纤维细胞计数及真皮厚度测量，饱和苦味酸-天狼猩红染色观察皮肤Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维的表达及Gomori醛品红染色观察弹力纤维的变化。结果：两组照射组中真皮厚度、成纤维细胞计数和弹力纤维容积分数的值均高于正常对照组（P均<0.05）；点阵CO2激光组均高于Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）组（P均<0.05）；两组照射组中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白容积分数均高于正常对照组（P均<0.05），但照射两组间差别无统计学意义。结论：点阵CO2激光和Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）均可引发小鼠真皮重塑，前者效果优于后者。
[关键词]点阵CO2激光；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）；自然老化小鼠；真皮重塑
[中图分类号]R616.4 R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）10-0-0
激光医学的迅速发展，已经广泛地应用于皮肤科的临床实践中。近几年，非剥脱性激光以及点阵激光的发展更为迅速，已经占有了一席之地[1-2]。虽然有关两者作用机制的研究也有报道[3-4]，但是二者针对皮肤组织结构作用机制的比较研究却鲜见报道。通过对二者作用的靶组织或细胞变化的深入比较研究，可以进一步揭开二者作用差异的面纱，为临床制定具体治疗方法提供理论依据。因此，本实验旨在分析点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）对昆明小鼠真皮的影响并进行对比研究，以进一步明确其作用机制的差异。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：清洁级雌性自然老化昆明小白鼠24只，体重（45±7）g，鼠龄11～12个月，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2仪器设备：点阵CO2激光治疗仪（上海康奥），Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）（韩国Lutronic S6）；石蜡切片机（德国Leica）；偏振光显微镜（奥林巴斯）；光学显微镜及医学图像分析系统（麦克奥迪）。
1.2 实验方法：10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔麻醉。小鼠背部皮肤脱毛后，以脊柱为纵线和垂直于脊柱纵线的二分之一处为横线将背部皮肤分为四个区。左侧为对照区，不做任何处理；右侧头部区为点阵CO2激光照射区（简称点阵区），尾部区为Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射区（简称长脉宽区）。照射区皮肤用1‰新洁尔灭常规消毒后自然干燥。点阵CO2激光照射的能量为50mJ/cm2，正方形光斑（4mm×4mm），脉宽2ms，密度100/cm2，光斑之间不重叠照射一遍；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射的能量为14.1mJ/cm2，圆形光斑（3.0mm），脉宽0.3ms，光斑重叠1/3，照射两遍；两组照射面积均约2cm×2cm。24只小鼠激光照射4次，每次间隔10天，全部照射结束后，分别在第2周、1个月、3个月各处死8只小鼠，分别取每只小鼠四个部位的皮肤用于进一步实验。
1.3 组织学观察：每只小鼠的四块样本，以10%甲醛溶液固定，乙醇梯次浓度逐级脱水，石蜡包埋，切片。常规HE切片用于计算成纤维细胞计数及测量真皮厚度；饱和苦味酸-天狼猩红染色切片用偏振光显微镜照相以分析Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维含量；Gomori醛品红染色切片用于分析弹力纤维含量。以上所有切片标本均以每张切片随机选取三个视野，用Motic医学图像分析软件分析，最后取均值作为该切片的分值。
1.4 统计学分析：所有数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。相关表格均由Microsoft Excel 2007绘制。计量资料采用x±s进行描述，资料进行正态性检验及方差齐性检验后， Wilcoxon秩检验或t检验用于两组间的比较，方差分析比较各时间段之间的差别，两两比较采用LSD法，规定检验水准α=0.05，P<0.05为差别具有统计学意义。
2 结果
肉眼观察可见点阵CO2激光照射自然老化昆明小白鼠后，照射区域皮肤表面即刻呈现均匀的黄褐色点状结痂，轻度水肿，次日水肿消失，点状结痂3～7日脱落。脱痂后皮肤表面光滑，无瘢痕及色素异常；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射区域皮肤表面微红，无结痂，次日皮肤基本恢复正常。
2.1 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对成纤维细胞数量及真皮厚度的影响：点阵CO2激光和Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1个月及3个月，HE染色标本显示两种激光照射区相对于对照区成纤维细胞计数及真皮厚度均显著增加，点阵CO2激光照射较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射效果明显（见表1、表2、图2）。在照射后一个月，点阵CO2激光较Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）成纤维细胞计数及真皮厚度差别显著（见图1）。
2.2 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对胶原增生的影响：点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后，经偏振光镜检饱和苦味酸-天狼猩红切片可见Ⅰ型胶原纤维呈红黄色，较粗大，而Ⅲ型胶原纤维呈绿色细丝状，交织于Ⅰ型胶原纤维间。在两波长激光分别照射后2周、1个月及3个月，照射区与对照区相比，Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维容积分数增加明显（见表3、表4、图4）。点阵CO2激光与Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射后一个月的Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维容积分数差别不明显（见图3）。
2.3点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对弹力纤维增生的影响：点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1个月及3个月，Gomori醛品红染色标本显示照射区弹力纤维染色深，呈较长细丝状，波浪状交织于增生胶原纤维间（见图5箭头所示），而对照区真皮弹力纤维短、染色浅；在激光照射后一个月，点阵CO2激光较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射区的弹力纤维容积分数增加明显（见表5、图6）。 2.4 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射区在不同时间段的方差：分析比较：（见表6）。
3 讨论
2004年Manstein等[2]发表点阵式光热作用（fractional photothermolysis， FP）理论，并迅速应用于临床，减少了治疗风险，并显现出良好的疗效。点阵CO2激光照射的是小部分皮肤，为三维的热治疗区域（Microscopic treatment zones，MTZs），每个MTZ形成热损伤区域（10～100μm），其外周为未损伤的正常组织。点状的损伤可以通过周围存在的未受损细胞迁移使表皮细胞迅速修复，从而使治疗后皮肤能快速恢复，无需休假，避免了传统剥脱性治疗的风险[5]。Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）几乎不损伤表皮细胞即可达到嫩肤的作用[6]。
皮肤老化常表现为皱纹、皮肤弹性下降、色素损害、毛细血管扩张等。显微镜下组织学改变表现为胶原纤维、弹力纤维减少，真皮层变薄。真皮层的主要结构为大量的成束的纵横交错的胶原纤维和少量的弹性纤维组织。因此，所谓的真皮重塑主要表现或者指标也就是Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维合成的重新启动。诸多的研究已证实激光照射后Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维合成大于降解[7，8]。点阵激光照射后Ⅲ型胶原纤维3天开始合成[9]，7天可见Ⅲ型胶原纤维沉积[10]。点阵CO2激光治疗面部萎缩性痤疮瘢痕[11]及手背部皮肤[12]，发现1个月时痤疮疤痕及皮肤光老化改善明显，有新的胶原沉积。国内罗瑶佳等[13]用超脉冲二氧化碳点阵激光治疗皮肤痤疮瘢痕，于1个月及3个月时观察疗效满意。Chiba等[4]在用Nd：YAG激光进行面部嫩肤治疗后发现改善皱纹，皮肤质地及松弛效果明显，真皮乳头层胶原纤维沉积明显。以上报道基本与本实验结果相符[14]。本实验研究对象为自然老化小鼠，与人类的自然老化有相同之处，通过对其研究可以为人类临床美肤提供科学理论依据[15]。本研究发现2周时在照射区域出现Ⅰ型胶原纤维沉积，1月时达到最高值，3月时沉积较前减少，但仍高于对照区，这些结果有助于我们了解激光照射后刺激胶原纤维合成的时间；而Ⅲ型胶原纤维至3月时仍呈现明显沉积趋势，其合成大于降解[9]，可能与Ⅲ型胶原纤维在老化皮肤沉积较多有关[16]；同时，弹力纤维亦呈现出时间依赖性沉积关系[17]；均表明其临床治疗间隔可以在三个月以后进行。
本实验结果表明，点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射均可明显引发真皮重塑，前者较后者具有更好的照射效果，造成这种差异的可能原因在于点阵CO2激光的波长（10600nm）高于Nd：YAG激光波长（1 064nm）。相比而言，较长的点阵CO2激光波长穿透能力强，可达真皮的中层，能够更好的将机械效应及光热效应作用于真皮中上层的成纤维细胞及真皮血管，激活组织自我修复，其中成纤维细胞和真皮血管内皮细胞分泌的炎症介质和细胞因子可能参与组织修复，刺激成纤维细胞增殖，使胶原蛋白发生重组和增生；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）其作用机理可能是真皮及其血管受激光光热效应及机械效应损伤，胶原蛋白热变性，继而激活组织修复过程，引发成纤维细胞增殖，引起胶原蛋白重组增生以达到真皮重塑的目的[6]。点阵CO2激光照射后的成纤维细胞数目及真皮厚度在1个月时较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射效果明显，但其长期效果并不具有明显优势，说明二者均能有效改善皮肤质地、增加皮肤弹性，是进行真皮重塑的很好的选择。比较多位学者的治疗结果，发现点阵CO2激光效果虽好，但点阵CO2激光治疗时患者的疼痛感高于Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长），且恢复期也较长[4，11]。相对临床而言，二者皆可作为治疗皮肤光老化进行真皮重塑的良好选择[3，18]，Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）损伤小，停工期短，更适合现在的快节奏生活，但对于较重的老化皮肤或对疗效有强烈愿望，建议用点阵CO2激光。本实验未明确真皮发生变化的分子机理，有待于在今后的学习中进一步研究。
[参考文献]
[1]Laubach H， Chan H H， Rius F， et al. Effects of skin temperature on lesion size in fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med， 2007，39（1）：14-18.
[2]Manstein D， Herron G S， Sink R K， et al. Fractional photothermolysis： a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury[J]. Lasers Surg Med， 2004，34（5）：426-438.
[3]Helbig D， Paasch U. Molecular changes during skin aging and wound healing after fractional ablative photothermolysis[J]. Skin Res Technol， 2011，17（1）：119-128.
[4]Chiba C， Usui A， Hara H， et al. Clinical experience in skin rejuvenation treatment in Asians using a long-pulse Nd：YAG laser[J]. J Cosmet Laser Ther， 2009，11（3）：134-138.
[5]Geronemus R G. Fractional photothermolysis： current and future applications[J]. Lasers Surg Med， 2006，38（3）：169-176. [6]Orringer J S， Voorhees J J， Hamilton T， et al. Dermal matrix remodeling after nonablative laser therapy[J]. J Am Acad Dermatol， 2005，53（5）：775-782.
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[10]Laubach HJ，Tannous Z，Anderson RR，et al.Skin responses to fractional photothermolysis[J]. Lasers Surg Med，2006，38（2）：142-149.
[11]Manuskiatti W，Triwongwaranat D，Varothai S，et al. Efficacy and safety of a carbon-dioxide ablative fractional resurfacing device for treatment of atrophic acne scars in Asians[J]. J Am Acad Dermatol，2010，63（2）：274-283.
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[18]Wattanakrai P，Rojhirunsakool S，Pootongkam S.Split-face comparison of long-pulse-duration neodymium-doped yttrium aluminum garnet （Nd：YAG） 1，064-nm laser alone and combination long-pulse and Q-switched Nd：YAG 1，064-nm laser with carbon photoenhancer lotion for the treatment of enlarged pores in Asian women[J].Dermatol Surg， 2010，36（11）：1672-1680.
[收稿日期]2012-06-15 [修回日期]2012-08-21
编辑/张惠娟
[关键词]点阵CO2激光；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）；自然老化小鼠；真皮重塑
[中图分类号]R616.4 R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）10-0-0
激光医学的迅速发展，已经广泛地应用于皮肤科的临床实践中。近几年，非剥脱性激光以及点阵激光的发展更为迅速，已经占有了一席之地[1-2]。虽然有关两者作用机制的研究也有报道[3-4]，但是二者针对皮肤组织结构作用机制的比较研究却鲜见报道。通过对二者作用的靶组织或细胞变化的深入比较研究，可以进一步揭开二者作用差异的面纱，为临床制定具体治疗方法提供理论依据。因此，本实验旨在分析点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）对昆明小鼠真皮的影响并进行对比研究，以进一步明确其作用机制的差异。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：清洁级雌性自然老化昆明小白鼠24只，体重（45±7）g，鼠龄11～12个月，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.1.2仪器设备：点阵CO2激光治疗仪（上海康奥），Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）（韩国Lutronic S6）；石蜡切片机（德国Leica）；偏振光显微镜（奥林巴斯）；光学显微镜及医学图像分析系统（麦克奥迪）。
1.2 实验方法：10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔麻醉。小鼠背部皮肤脱毛后，以脊柱为纵线和垂直于脊柱纵线的二分之一处为横线将背部皮肤分为四个区。左侧为对照区，不做任何处理；右侧头部区为点阵CO2激光照射区（简称点阵区），尾部区为Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射区（简称长脉宽区）。照射区皮肤用1‰新洁尔灭常规消毒后自然干燥。点阵CO2激光照射的能量为50mJ/cm2，正方形光斑（4mm×4mm），脉宽2ms，密度100/cm2，光斑之间不重叠照射一遍；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射的能量为14.1mJ/cm2，圆形光斑（3.0mm），脉宽0.3ms，光斑重叠1/3，照射两遍；两组照射面积均约2cm×2cm。24只小鼠激光照射4次，每次间隔10天，全部照射结束后，分别在第2周、1个月、3个月各处死8只小鼠，分别取每只小鼠四个部位的皮肤用于进一步实验。
1.3 组织学观察：每只小鼠的四块样本，以10%甲醛溶液固定，乙醇梯次浓度逐级脱水，石蜡包埋，切片。常规HE切片用于计算成纤维细胞计数及测量真皮厚度；饱和苦味酸-天狼猩红染色切片用偏振光显微镜照相以分析Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维含量；Gomori醛品红染色切片用于分析弹力纤维含量。以上所有切片标本均以每张切片随机选取三个视野，用Motic医学图像分析软件分析，最后取均值作为该切片的分值。
1.4 统计学分析：所有数据采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。相关表格均由Microsoft Excel 2007绘制。计量资料采用x±s进行描述，资料进行正态性检验及方差齐性检验后， Wilcoxon秩检验或t检验用于两组间的比较，方差分析比较各时间段之间的差别，两两比较采用LSD法，规定检验水准α=0.05，P<0.05为差别具有统计学意义。
2 结果
肉眼观察可见点阵CO2激光照射自然老化昆明小白鼠后，照射区域皮肤表面即刻呈现均匀的黄褐色点状结痂，轻度水肿，次日水肿消失，点状结痂3～7日脱落。脱痂后皮肤表面光滑，无瘢痕及色素异常；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射区域皮肤表面微红，无结痂，次日皮肤基本恢复正常。
2.1 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对成纤维细胞数量及真皮厚度的影响：点阵CO2激光和Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1个月及3个月，HE染色标本显示两种激光照射区相对于对照区成纤维细胞计数及真皮厚度均显著增加，点阵CO2激光照射较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射效果明显（见表1、表2、图2）。在照射后一个月，点阵CO2激光较Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）成纤维细胞计数及真皮厚度差别显著（见图1）。
2.2 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对胶原增生的影响：点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后，经偏振光镜检饱和苦味酸-天狼猩红切片可见Ⅰ型胶原纤维呈红黄色，较粗大，而Ⅲ型胶原纤维呈绿色细丝状，交织于Ⅰ型胶原纤维间。在两波长激光分别照射后2周、1个月及3个月，照射区与对照区相比，Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维容积分数增加明显（见表3、表4、图4）。点阵CO2激光与Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射后一个月的Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维容积分数差别不明显（见图3）。
2.3点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射对弹力纤维增生的影响：点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射自然老化昆明小白鼠后2周、1个月及3个月，Gomori醛品红染色标本显示照射区弹力纤维染色深，呈较长细丝状，波浪状交织于增生胶原纤维间（见图5箭头所示），而对照区真皮弹力纤维短、染色浅；在激光照射后一个月，点阵CO2激光较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射区的弹力纤维容积分数增加明显（见表5、图6）。 2.4 点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射区在不同时间段的方差：分析比较：（见表6）。
3 讨论
2004年Manstein等[2]发表点阵式光热作用（fractional photothermolysis， FP）理论，并迅速应用于临床，减少了治疗风险，并显现出良好的疗效。点阵CO2激光照射的是小部分皮肤，为三维的热治疗区域（Microscopic treatment zones，MTZs），每个MTZ形成热损伤区域（10～100μm），其外周为未损伤的正常组织。点状的损伤可以通过周围存在的未受损细胞迁移使表皮细胞迅速修复，从而使治疗后皮肤能快速恢复，无需休假，避免了传统剥脱性治疗的风险[5]。Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）几乎不损伤表皮细胞即可达到嫩肤的作用[6]。
皮肤老化常表现为皱纹、皮肤弹性下降、色素损害、毛细血管扩张等。显微镜下组织学改变表现为胶原纤维、弹力纤维减少，真皮层变薄。真皮层的主要结构为大量的成束的纵横交错的胶原纤维和少量的弹性纤维组织。因此，所谓的真皮重塑主要表现或者指标也就是Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维合成的重新启动。诸多的研究已证实激光照射后Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维合成大于降解[7，8]。点阵激光照射后Ⅲ型胶原纤维3天开始合成[9]，7天可见Ⅲ型胶原纤维沉积[10]。点阵CO2激光治疗面部萎缩性痤疮瘢痕[11]及手背部皮肤[12]，发现1个月时痤疮疤痕及皮肤光老化改善明显，有新的胶原沉积。国内罗瑶佳等[13]用超脉冲二氧化碳点阵激光治疗皮肤痤疮瘢痕，于1个月及3个月时观察疗效满意。Chiba等[4]在用Nd：YAG激光进行面部嫩肤治疗后发现改善皱纹，皮肤质地及松弛效果明显，真皮乳头层胶原纤维沉积明显。以上报道基本与本实验结果相符[14]。本实验研究对象为自然老化小鼠，与人类的自然老化有相同之处，通过对其研究可以为人类临床美肤提供科学理论依据[15]。本研究发现2周时在照射区域出现Ⅰ型胶原纤维沉积，1月时达到最高值，3月时沉积较前减少，但仍高于对照区，这些结果有助于我们了解激光照射后刺激胶原纤维合成的时间；而Ⅲ型胶原纤维至3月时仍呈现明显沉积趋势，其合成大于降解[9]，可能与Ⅲ型胶原纤维在老化皮肤沉积较多有关[16]；同时，弹力纤维亦呈现出时间依赖性沉积关系[17]；均表明其临床治疗间隔可以在三个月以后进行。
本实验结果表明，点阵CO2激光及Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）照射均可明显引发真皮重塑，前者较后者具有更好的照射效果，造成这种差异的可能原因在于点阵CO2激光的波长（10600nm）高于Nd：YAG激光波长（1 064nm）。相比而言，较长的点阵CO2激光波长穿透能力强，可达真皮的中层，能够更好的将机械效应及光热效应作用于真皮中上层的成纤维细胞及真皮血管，激活组织自我修复，其中成纤维细胞和真皮血管内皮细胞分泌的炎症介质和细胞因子可能参与组织修复，刺激成纤维细胞增殖，使胶原蛋白发生重组和增生；Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）其作用机理可能是真皮及其血管受激光光热效应及机械效应损伤，胶原蛋白热变性，继而激活组织修复过程，引发成纤维细胞增殖，引起胶原蛋白重组增生以达到真皮重塑的目的[6]。点阵CO2激光照射后的成纤维细胞数目及真皮厚度在1个月时较Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长）照射效果明显，但其长期效果并不具有明显优势，说明二者均能有效改善皮肤质地、增加皮肤弹性，是进行真皮重塑的很好的选择。比较多位学者的治疗结果，发现点阵CO2激光效果虽好，但点阵CO2激光治疗时患者的疼痛感高于Nd：YAG激光（准长脉宽1064nm波长），且恢复期也较长[4，11]。相对临床而言，二者皆可作为治疗皮肤光老化进行真皮重塑的良好选择[3，18]，Nd：YAG激光（准长脉宽1 064nm波长）损伤小，停工期短，更适合现在的快节奏生活，但对于较重的老化皮肤或对疗效有强烈愿望，建议用点阵CO2激光。本实验未明确真皮发生变化的分子机理，有待于在今后的学习中进一步研究。
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[收稿日期]2012-06-15 [修回日期]2012-08-21
编辑/张惠娟