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摘要 采用同源克隆方法从绿竹基因组中获得2个P5CS基因组片段：DoP5CS1长度为2 178 bp，包含7个内含子和8个外显子，外显子编码序列为976 bp，编码325个氨基酸残基，编码蛋白分子量34.787 4 kD，等电点（PI）5.27，N端有一个氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能区，C端有一个醛脱氢酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能区；DoP5CS2大小与DoP5CS1外显子序列相同为976 bp，相似性达99.6%，但缺失内含子，推测DoP5CS2为返座假基因。该研究为基因全长序列的获取和功能分析以及通过分子生物学手段提高绿竹乃至其他竹类植物的抗逆性奠定基础。
关键词 绿竹；P5CS；克隆；脯氨酸
中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-025-05
竹子属禾本科（Gramineae）竹亚科（Bambusoideae）多年生常绿植物，四季常青，枝叶茂盛，是极其重要的非木材可再生林业资源，是园林绿化的重要植物。竹子喜温暖怕风寒，喜湿润怕干旱，喜肥，喜酸性怕碱性[1]。由于受各地气温的影响，大部分竹种在分布上具有明显的地带性和区域性，其中福建、江西、浙江和湖南4省为主要产区。竹子的栽培区域多集中在南方，虽然人们在“南竹北移”引种研究上作了大量工作，通过引种驯化，使一些竹种能够在华北、西北等气候较寒冷、干燥的地区生长，但温度和水分一直是限制一些极具经济价值和观赏价值的竹种得不到进一步推广种植的主要因子[2]；而且引种后需要采取一系列行之有效的栽培技术措施来改善不良的环境条件，以满足竹子的生长发育，但存在环境可控性差、生产成本较高和竹林生长不良等问题。如何利用现代生物技术改变竹子自身，如通过转基因等分子生物学手段的处理，改变竹子的生物学和生态学特性，使其主动适应不良环境[3]，提高抗逆性，已成为竹类植物遗传改良的必然选择。
植物在适应低温、干旱等胁迫时，往往通过生理生化的变化来适应，包括胁迫响应的功能和基因调控[4]。如植物膜脂发生改变[5]、糖和脯氨酸含量增高[6-7]、蛋白质组成发生变化[8]以及叶绿体的超微结构发生改变[9]等，其中脯氨酸（Proline）在渗透平衡中起着重要的调节作用，对细胞的膨压增加有保护作用[10]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase， P5CS）是脯氨酸合成限速酶。P5CS基因全长cDNA序列已经在许多植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、豇豆（Vigna aconitifolia）和盐地碱蓬（Suaeda salsa）等被克隆并研究。而其基因组序列的研究较少，如在拟南芥基因组中克隆出P5CS基因序列（X86778），全长序列为5 789 bp，包含19个内含子和20个外显子；在甘蔗（Saccharum officinarum）基因组中克隆出2 016 bp的P5CS基因组片段（EF620362），包含7个内含子和8个外显子[11]。
笔者以经长期进化适应比较抗寒的大型丛生竹种绿竹（Dendrocalamopsis oldhami）为试材，通过P5CS基因的扩增、测序及序列分析，旨在为今后该基因全长序列及其功能研究奠定基础，为竹子遗传转化、抗寒新品种培育及抗逆分子育种提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料绿竹嫩叶采自福建华安竹种园，采集时经变性硅胶快速干燥后带回实验室置于-70 ℃冰箱保存备用。
1.2 试剂
TA克隆载体pMD18-T Vector、Taq酶及PCR试剂购自TaKaRa公司，GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、氨苄抗生素、IPTG和X-Gal购自生工生物工程上海（股份）有限公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.3 引物
根据NCBI的GenBank与DDBJ数据库中的P5CS基因比对结果中保守区的核苷酸序列[11]，采用生物学软件Primer Premier 5.0分析设计引物，引物长度20～22 bp，GC含量45%，退火温度53 ℃。引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，序列
F1：5′-GATTCATCTGGTATATCCTGGG-3′；
R1：5′-TTACTCCCTCTTGGAATGAC-3′。
1.4 基因组DNA的提取
采用改良的CTAB法提取绿竹基因组DNA[12]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取1 μl在1%TAE琼脂糖凝胶上检测DNA的质量，然后定量至100 ng/μl，-20 ℃保存备用。
1.5 P5CS基因序列扩增与测序
上述基因组DNA 1 μl，10×PCR Buffer 2 μl，MgCl2 1.2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Taq酶0.1 μl，加ddH2O至20 μl后进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，
53 ℃延伸30 s，72 ℃退火2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR产物经回收、连接、大肠杆菌转化和菌液PCR检测后，将阳性克隆的菌液送上海生工进行测序。 1.6 序列分析
将测序获得的序列与GenBank核酸序列数据库中的序列用blastn程序进行相似性比对；利用Vector NTI 11.5.1软件选取Clustal W方法对确定的P5CS基因序列与甘蔗ScP5CS基因（EF620362）进行比对；利用DNAMAN软件和http：//www.bio-soft.net/sms/index.html在线分析软件预测编码序列；通过NCBI数据库对预测氨基酸序列进行保守域检索。
43卷19期 钟 浩等 绿竹P5CS基因的扩增及序列分析
2 结果与分析
2.1 绿竹P5CS基因序列克隆
由图1可知，从绿竹基因组DNA中扩增出2条清晰的条带，分别为2 kb和1 kb左右。产物经回收、连接、大肠杆菌转化后，将获得的阳性克隆送上
海生工进行测序，测序结果分别为2 178和976 bp，经blastn程序相似性比对，确定为P5CS基因序列，命名为DoP5CS1和DoP5CS2。
2.2 绿竹DoP5CS基因片段核苷酸序列分析
通过分析可知，DoP5CS1包含7个内含子，大小分别为465、132、168、156、118、93和70 bp（图2），其中976 bp为外显子编码序列。
将DoP5CS2（图3）与DoP5CS1的外显子序列进行同源性分析，大小与外显子序列一致，只是有4个碱基的差异，相似性达99.6%，缺失了DoP5CS1的内含子（图4），推测DoP5CS2为返座假基因序列。
将DoP5CS1与甘蔗ScP5CS基因片段（EF620362）进行比对（图5），结果显示相似性为78%。
2.3 绿竹DoP5CS基因片段预测的氨基酸序列分析
将DoP5CS1的外显子与甘蔗ScP5CS基因片段的外显子（EF620362.1 GI：149900513）进行比对（图6），相似性为87%，但发现缺失了一个碱基（图中箭头所示），这可能是由于PCR扩增或测序时出错导致的。
鉴于碱基缺失会导致读码框位移，在此以977 bp对其氨基酸序列进行预测（图7），共编码325个氨基酸残基，分子量34.787 4 kD，等电点（PI）5.27。
分析其结构特点发现，具有P5CS共有的结构域[11]：Putative leucine domain； Glutamate-5-kinase domain； Putative NADPH-binding domain保守区。
将预测的绿竹DoP5CS1基因氨基酸序列与甘蔗ScP5CS基因氨基酸序列（ABR32187）进行同源性分析（图8），发现相似性为90%。
将预测的绿竹DoP5CS1基因氨基酸序列在NCBI数据库进行保守域检索（图9），结果显示其N端有一个氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能区，C端有一个醛脱氢酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能区。
3 讨论
该研究克隆获得的DoP5CS1片段包含7个内含子和8个外显子，而DoP5CS2片段具有大多数返座假基因鲜明特征：完全缺失存在于功能基因中的间隔序列，即内含子序列[13]。因此，推测DoP5CS2片段可能为返座假基因。
在生物的演变进程中，基因序列在复制过程中不断发生各种变化，包括突变、漂移、插入和缺失等，这些变化有可能导致其失去编码功能，成为假基因[14]。Makalowski[15]认为这些基因片段与它们邻近的基因相互作用而影响生物的进化。该研究从绿竹基因组中获得了P5CS基因的返座假基因片段，说明绿竹与其他植物一样，在其长期进化过程中由于突变等原因产生一些基因片段，这些基因片段与其功能基因相互作用影响绿竹的遗传多样性。
通过氨基酸序列分析发现，获得的绿竹DoP5CS1基因与其他植物的P5CS基因一样，均有共同的NADPH的结合位点，这与马丽清[16]的研究结果一致。
该研究获得的绿竹DoP5CS1基因片段的结构信息，为该基因全长序列的获取及其功能研究奠定基础；也为研究绿竹脯氨酸合成酶系基因及通过分子生物学手段提高绿竹乃至其他竹类植物的抗逆性提供了线索。
参考文献
[1] 卢萍，罗明灿，刘清江.我国北方地区竹子引种中存在的问题及对策分析[J].林业调查规划，2009，34（4）：100-104.
[2] 刘秋芳，张旭东，周金星，等.我国竹子抗寒性研究进展[J].世界林业研究，2006，19（5）：59-62.
[3] 周滔.“南竹北移”栽培技术简介[J].云南林业，2002，23（4）：16.
[4] CHINNUSAMY V，ZHU J，ZHU J K.Cold stress regulation of gene expression in plants[J].Trends Plant Sci，2007，12：444-451.
[5] UEMURA M，JOSEPH R A，STRPONKUS P L.Cold acclimation of Arabidopsis thaliana.Effect on plasma membrane lipid composition and freeze-induced lesions[J].Plant Physiol，1995，109：15-30.
[6] GILMOUR S J，SEBOLT A M，SALAZAR M P，et al.Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J].Plant Physiol，2000，124：1854-1865. [7] MEDINA J，CATALA R，SALINAS J.Developmental and stress regulation of RCI2A and RCI2B，two cold-inducible genes of Arabidopsis encoding highly conserved hydrophobic proteins[J].Plant Physiol，2001，125：1655-1666.
[8] RISTIC Z，ASHWORTH E N.Changes in leaf ultrastructure and carbohydrates in Arabidopsis thaliana L.（Heynh） cv.Columbia during rapid cold acclimation[J].Protoplasma，1993，172：111-123.
[9] 李大红，焦江洪，赵丽，等.转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性[J].江苏农业学报，2014，30（6）：1442-1447.
[10] KUMAR V，SHRIRAM V，KAVI-KISHOR P B，et al.Enhanced proline accumulation and salt stress tolerance of transgenic indica rice by over-expressing P5CSF129A gene[J].Plant Biotechnol Rep，2010，4：37-48.
[11] 黄诚梅.甘蔗脯氨酸积累与Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因克隆及转化研究[D].南宁：广西大学，2007.
[12] DOYLE J J，DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemistry Bull，1987，19：11-15.
[13] 崔峰，夏家辉.关于假基因的研究进展[J].生命科学研究，1999，3（3）：203-209.
[14] 马长乐，周浙昆.ITS假基因对栎属系统学研究的影响及其对分子系统学研究的启示[J].云南植物研究，2006，28（2）：127-132.
[15] MAKALOWSKI W.Genomic scrap yard：how genomes utilize all that junk[J].Gene，2000，259（1/2）：61-67.
[16] 马丽清.小麦耐盐相关基因的作图及克隆[D].北京：中国农业大学，2005.
关键词 绿竹；P5CS；克隆；脯氨酸
中图分类号 S188+.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）19-025-05
竹子属禾本科（Gramineae）竹亚科（Bambusoideae）多年生常绿植物，四季常青，枝叶茂盛，是极其重要的非木材可再生林业资源，是园林绿化的重要植物。竹子喜温暖怕风寒，喜湿润怕干旱，喜肥，喜酸性怕碱性[1]。由于受各地气温的影响，大部分竹种在分布上具有明显的地带性和区域性，其中福建、江西、浙江和湖南4省为主要产区。竹子的栽培区域多集中在南方，虽然人们在“南竹北移”引种研究上作了大量工作，通过引种驯化，使一些竹种能够在华北、西北等气候较寒冷、干燥的地区生长，但温度和水分一直是限制一些极具经济价值和观赏价值的竹种得不到进一步推广种植的主要因子[2]；而且引种后需要采取一系列行之有效的栽培技术措施来改善不良的环境条件，以满足竹子的生长发育，但存在环境可控性差、生产成本较高和竹林生长不良等问题。如何利用现代生物技术改变竹子自身，如通过转基因等分子生物学手段的处理，改变竹子的生物学和生态学特性，使其主动适应不良环境[3]，提高抗逆性，已成为竹类植物遗传改良的必然选择。
植物在适应低温、干旱等胁迫时，往往通过生理生化的变化来适应，包括胁迫响应的功能和基因调控[4]。如植物膜脂发生改变[5]、糖和脯氨酸含量增高[6-7]、蛋白质组成发生变化[8]以及叶绿体的超微结构发生改变[9]等，其中脯氨酸（Proline）在渗透平衡中起着重要的调节作用，对细胞的膨压增加有保护作用[10]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase， P5CS）是脯氨酸合成限速酶。P5CS基因全长cDNA序列已经在许多植物，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、豇豆（Vigna aconitifolia）和盐地碱蓬（Suaeda salsa）等被克隆并研究。而其基因组序列的研究较少，如在拟南芥基因组中克隆出P5CS基因序列（X86778），全长序列为5 789 bp，包含19个内含子和20个外显子；在甘蔗（Saccharum officinarum）基因组中克隆出2 016 bp的P5CS基因组片段（EF620362），包含7个内含子和8个外显子[11]。
笔者以经长期进化适应比较抗寒的大型丛生竹种绿竹（Dendrocalamopsis oldhami）为试材，通过P5CS基因的扩增、测序及序列分析，旨在为今后该基因全长序列及其功能研究奠定基础，为竹子遗传转化、抗寒新品种培育及抗逆分子育种提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料绿竹嫩叶采自福建华安竹种园，采集时经变性硅胶快速干燥后带回实验室置于-70 ℃冰箱保存备用。
1.2 试剂
TA克隆载体pMD18-T Vector、Taq酶及PCR试剂购自TaKaRa公司，GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、氨苄抗生素、IPTG和X-Gal购自生工生物工程上海（股份）有限公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.3 引物
根据NCBI的GenBank与DDBJ数据库中的P5CS基因比对结果中保守区的核苷酸序列[11]，采用生物学软件Primer Premier 5.0分析设计引物，引物长度20～22 bp，GC含量45%，退火温度53 ℃。引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，序列
F1：5′-GATTCATCTGGTATATCCTGGG-3′；
R1：5′-TTACTCCCTCTTGGAATGAC-3′。
1.4 基因组DNA的提取
采用改良的CTAB法提取绿竹基因组DNA[12]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取1 μl在1%TAE琼脂糖凝胶上检测DNA的质量，然后定量至100 ng/μl，-20 ℃保存备用。
1.5 P5CS基因序列扩增与测序
上述基因组DNA 1 μl，10×PCR Buffer 2 μl，MgCl2 1.2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Taq酶0.1 μl，加ddH2O至20 μl后进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，
53 ℃延伸30 s，72 ℃退火2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR产物经回收、连接、大肠杆菌转化和菌液PCR检测后，将阳性克隆的菌液送上海生工进行测序。 1.6 序列分析
将测序获得的序列与GenBank核酸序列数据库中的序列用blastn程序进行相似性比对；利用Vector NTI 11.5.1软件选取Clustal W方法对确定的P5CS基因序列与甘蔗ScP5CS基因（EF620362）进行比对；利用DNAMAN软件和http：//www.bio-soft.net/sms/index.html在线分析软件预测编码序列；通过NCBI数据库对预测氨基酸序列进行保守域检索。
43卷19期 钟 浩等 绿竹P5CS基因的扩增及序列分析
2 结果与分析
2.1 绿竹P5CS基因序列克隆
由图1可知，从绿竹基因组DNA中扩增出2条清晰的条带，分别为2 kb和1 kb左右。产物经回收、连接、大肠杆菌转化后，将获得的阳性克隆送上
海生工进行测序，测序结果分别为2 178和976 bp，经blastn程序相似性比对，确定为P5CS基因序列，命名为DoP5CS1和DoP5CS2。
2.2 绿竹DoP5CS基因片段核苷酸序列分析
通过分析可知，DoP5CS1包含7个内含子，大小分别为465、132、168、156、118、93和70 bp（图2），其中976 bp为外显子编码序列。
将DoP5CS2（图3）与DoP5CS1的外显子序列进行同源性分析，大小与外显子序列一致，只是有4个碱基的差异，相似性达99.6%，缺失了DoP5CS1的内含子（图4），推测DoP5CS2为返座假基因序列。
将DoP5CS1与甘蔗ScP5CS基因片段（EF620362）进行比对（图5），结果显示相似性为78%。
2.3 绿竹DoP5CS基因片段预测的氨基酸序列分析
将DoP5CS1的外显子与甘蔗ScP5CS基因片段的外显子（EF620362.1 GI：149900513）进行比对（图6），相似性为87%，但发现缺失了一个碱基（图中箭头所示），这可能是由于PCR扩增或测序时出错导致的。
鉴于碱基缺失会导致读码框位移，在此以977 bp对其氨基酸序列进行预测（图7），共编码325个氨基酸残基，分子量34.787 4 kD，等电点（PI）5.27。
分析其结构特点发现，具有P5CS共有的结构域[11]：Putative leucine domain； Glutamate-5-kinase domain； Putative NADPH-binding domain保守区。
将预测的绿竹DoP5CS1基因氨基酸序列与甘蔗ScP5CS基因氨基酸序列（ABR32187）进行同源性分析（图8），发现相似性为90%。
将预测的绿竹DoP5CS1基因氨基酸序列在NCBI数据库进行保守域检索（图9），结果显示其N端有一个氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能区，C端有一个醛脱氢酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能区。
3 讨论
该研究克隆获得的DoP5CS1片段包含7个内含子和8个外显子，而DoP5CS2片段具有大多数返座假基因鲜明特征：完全缺失存在于功能基因中的间隔序列，即内含子序列[13]。因此，推测DoP5CS2片段可能为返座假基因。
在生物的演变进程中，基因序列在复制过程中不断发生各种变化，包括突变、漂移、插入和缺失等，这些变化有可能导致其失去编码功能，成为假基因[14]。Makalowski[15]认为这些基因片段与它们邻近的基因相互作用而影响生物的进化。该研究从绿竹基因组中获得了P5CS基因的返座假基因片段，说明绿竹与其他植物一样，在其长期进化过程中由于突变等原因产生一些基因片段，这些基因片段与其功能基因相互作用影响绿竹的遗传多样性。
通过氨基酸序列分析发现，获得的绿竹DoP5CS1基因与其他植物的P5CS基因一样，均有共同的NADPH的结合位点，这与马丽清[16]的研究结果一致。
该研究获得的绿竹DoP5CS1基因片段的结构信息，为该基因全长序列的获取及其功能研究奠定基础；也为研究绿竹脯氨酸合成酶系基因及通过分子生物学手段提高绿竹乃至其他竹类植物的抗逆性提供了线索。
参考文献
[1] 卢萍，罗明灿，刘清江.我国北方地区竹子引种中存在的问题及对策分析[J].林业调查规划，2009，34（4）：100-104.
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[8] RISTIC Z，ASHWORTH E N.Changes in leaf ultrastructure and carbohydrates in Arabidopsis thaliana L.（Heynh） cv.Columbia during rapid cold acclimation[J].Protoplasma，1993，172：111-123.
[9] 李大红，焦江洪，赵丽，等.转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性[J].江苏农业学报，2014，30（6）：1442-1447.
[10] KUMAR V，SHRIRAM V，KAVI-KISHOR P B，et al.Enhanced proline accumulation and salt stress tolerance of transgenic indica rice by over-expressing P5CSF129A gene[J].Plant Biotechnol Rep，2010，4：37-48.
[11] 黄诚梅.甘蔗脯氨酸积累与Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因克隆及转化研究[D].南宁：广西大学，2007.
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[16] 马丽清.小麦耐盐相关基因的作图及克隆[D].北京：中国农业大学，2005.