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摘要：肠球菌（Enterococci）作为条件性致病菌广泛存在于人和动物中，其耐药性和致病性随地区和动物来源的不同而变化。据现有数据显示，关于武汉市马源肠球菌的耐药性研究相当匮乏。以武汉市2个马术俱乐部42匹温血马为主要研究对象，分别对马匹粪便进行样品搜集并进行耐药研究（氨苄西林，四环素，庆大霉素，头孢氨苄，恩诺沙星，氯霉素，诺氟沙星，红霉素，万古霉素、林可霉素等）。结果显示，从42份样本中分离出10株粪肠球菌，分离率为23.8%;藥敏试验结果显示，分离株中有6株为庆大霉素耐药，6株为头孢类抗生素耐药，2株为庆大霉素和头孢类抗生素混合耐药，其他药物未产生耐药性。结果表明该俱乐部马源肠球菌已对庆大霉素和头孢类抗生素产生严重耐药性，试验为该马术俱乐部用药提供了理论依据。
关键词：马源肠球菌（Enterococcus）;耐药性;武汉市
中图分类号：S852.61+1 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2021）07-0017-03
肠球菌（Enterococcus）为触媒阴性、单个或链状排列的格兰氏阳性球菌，是人及动物微生物群中正常存在的一部分，一般不会引起发病，属于条件性致病菌[1，2]。有学者报道，肠球菌属菌种有19个，主要有鸟肠球菌（E. avium）、病臭肠球菌（E. malodoratus）、棉子糖肠球菌（E. raffinosus）、粪肠球菌（E. faecalis）、屎肠球菌（E. faecium）、铅黄肠球菌（E. casseliflavus）、蒙氏肠球菌（E. mundtii）、殊异肠球菌（E. dispar）、盲肠肠球菌（E. cecorum）和孤立四联球菌（E. Solitarius）等，至2003年确定的肠球菌属已增至31种[3]。在正常人群中，坚忍肠球菌（E. durans）和海氏肠球菌（E. Hirae）携带率分别为18%和9%。而在家畜中，坚忍肠球菌主要存在于牛及仔鸡中。肠球菌的分布随地区不同而不同，在西班牙临床上主要的肠球菌种为粪肠球菌与屎肠球菌，而在瑞典等国家主要为屎肠球菌和海氏肠球菌。肠球菌一直被认为是非致病性阳性菌存在，临床风险很小，但近年来很多研究发现肠球菌是导致外科伤口、血液、泌尿道、脑膜和血管感染的主要医院病原体[4]，目前，由肠球菌引起的菌血症及心内膜炎已在医院广泛存在，其中粪肠球菌是主要病原体，其次是屎肠球菌，而其他肠球菌种很少见发病。
肠球菌细胞壁较厚，故对多种药物具有天然耐药性，但也更易被诱导产生新的耐药性。近年来，由于抗生素在临床上的广泛使用，肠球菌耐药菌株不断增多。至今万古霉素的耐药菌株已广泛存在，某些抗生素甚至达到完全耐药，且有研究表明，肠球菌携带的耐药基因可在人和动物之间进行传播，给临床治疗带来了很大难题，对动物及人类健康造成了严重威胁。然而，根据武汉马术协会数据显示，历年来武汉马术俱乐部及相关工作人员的数量呈现逐年递增的趋势，这无疑增加了人畜共患病原体的传播风险。由于武汉市马源肠球菌的耐药性调查数据极其缺乏，鉴于此，本研究对武汉马术俱乐部进行随机抽查，对其肠球菌分离和耐药情况进行调查，旨在为当地马匹疾病的防治提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验以武汉市2个马术俱乐部为主要研究对象，分别对42匹温血马匹进行粪便样品采集，于-20 ℃保存。采样时认真记录编号，并调查俱乐部饲养管理、既往病史、役用及用药情况。
1.2 试验方法
1.2.1 肠球菌的分离及初步鉴定 肠球菌的初步分离按照链球菌培养方式进行。样品做预处理后，置于含20%兔血清的营养肉汤中进行培养，过夜后蘸取菌液接种于TSA培养基中，24 h后观察菌落形态。表面扁平、光滑并呈灰白色菌落初步定为可疑菌落，并对可疑菌落进行格兰式染色（阳性球菌）、触酶试验（阴性者为肠球菌）、16 sDNA基因扩增等进行鉴定。
1.2.2 肠球菌耐药性研究 对“1.2.1”中的菌株进行KB纸片扩散试验，结果根据CLSI《美国临床实验室标准化协会》标准进行判定。
2 结果与分析
2.1 分离鉴定结果与分析
对2个马术俱乐部共计42份样本分离出的10个菌株样品分别进行革兰氏染色（图1）、生化试验（表1）和触酶试验鉴定，结果初步鉴定为粪肠球菌，分离率为23.8%。
对初步鉴定为肠球菌菌株再次进行16sDNA PCR扩增（图2），进一步确定为肠球菌。对16s DNA扩增引物测序并进行Blast对比分析，结果见图3。由图3可见，H8样本与粪肠球菌同源性最高。
2.2 耐药性试验结果
将所有分离菌株进行KB纸片扩散试验，结果显示10株肠球菌菌株中有6株为庆大霉素耐药（60%），6株为头孢类抗生素耐药（60%），2株为庆大霉素和头孢类抗生素混合耐药（20%），且据马主陈述，采样之前3个月内均未使用抗生素进行治疗。具体结果见表2和图4。
3 小结与讨论
肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。曾被认为是非致病性共生体，临床风险很小。最近调查显示，肠球菌是引起人类医院感染的第二大革兰氏阳性细菌，是导致手术伤口、尿路、脑膜和心内膜感染的主要医源病原体[5]。肠球菌对低至高水平的几种抗菌素本能具有耐药性，包括内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷类和林可亚胺[6]。医院感染率的增加可部分归因于人类医院大量使用抗菌素和肠球菌耐药（AR）菌株的发展[7]。然而，马源肠球菌研究相当匮乏[8]。
本试验结果显示，武汉市2个马术俱乐部粪肠球菌分离率为23.8%，与韩国赛马管理局统计数据和其他动物如藏猪分离率相比均较低[9]，这可能与本试验采样点局限性有关。 本试验结果说明2个马术俱乐部马源肠球菌耐药率较高，其中庆大霉素和头孢氨苄耐药率均达到60%，而混合耐药率为20%（庆大霉素和头孢氨苄）。本次试验结果耐药率较高，虽可能跟样本数量有关，但仍需引起注意。本次试验结果耐药性与藏猪源肠球菌耐药结果相似[9]，但与韩国马源耐药率（70.6%）相比较低，与葡萄牙部分地区马源肠球菌耐药性相比则较高（8.8%）[10，11]。
綜上所述，这是首次对武汉市马术俱乐部肠球菌进行采样耐药研究。结果显示，肠球菌优势种为粪肠球菌，且耐药性较为严重。通过韩国研究者报道显示，耐药性肠球菌在马之间或马与其环境之间可以传播，这意味着从马传播到人类尤其是成为骑手、马工等马业工作者的潜在风险。因此，笔者后期将继续研究武汉市马源肠球菌与周围环境之间的关系。
参考文献：
[1] FISHER K， PHILLIPS C. The ecology， epidemiology and virulence of Enterococcus[J]. Microbiology， 2009， 155： 1749-1757.
[2] MOHAMED J A， HUANG D B. Biofilm formation by enterococci[J]. J Med Microbioh ，2007， 56： 1581-1588.
[3] 李金钟.肠球菌分类与鉴定新进展[J].临床检验杂志，2006，24（3）：228-230.
[4] ARIAS C A， MURRAY B E. Emergence and management of drug-resistant enterococcal infections[J]. Expert Rev Anti Infect Ther，2008， 6（5）： 637-655.
[5] HIDRON A I ， EDWARDS J R， PATEL J， et al. NHSN annual update：antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated infections：annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention， 2006—2007[J]. Infect Control Hosp Epidemiol，2008， 29（11）： 996-1011.
[6] MURRAY B E. The life and times of the Enterococcus[J].Clin Microbiol Rev， 1990， 3（1）： 46-65.
[7] PALMER K L， KOS V N， GILMORE M S. Horizontal gene transfer and the genomics of enterococcal antibiotic resistance[J]. Curr Opin Micro biol， 2010， 13（5）： 632-639.
[8] 兰彦芳，余 刚，丁 鹏，等.武汉市马源肠球菌感染现状分析[J].湖北畜牧兽医， 2019， 40（8）： 5-8.
[9] 兰彦芳. 藏猪链球菌2型血清学调查及肠球菌耐药性研究[D].武汉：华中农业大学，2017.
[10]SINGH B R. Prevalence of vancomycin resistance and multiple drug resistance in enterococci in equids in North India[J]. J Infect Dev Ctries， 2009， 3（7）： 498-503.
[11] MOURA I， RADHOUANI H， TORRES C， et al. Detection and genetic characterisation of vanA-containing Enterococcus strains in healthy Lusitano horses[J]. Equine Vet J， 2010， 42（2）：181-183.
关键词：马源肠球菌（Enterococcus）;耐药性;武汉市
中图分类号：S852.61+1 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2021）07-0017-03
肠球菌（Enterococcus）为触媒阴性、单个或链状排列的格兰氏阳性球菌，是人及动物微生物群中正常存在的一部分，一般不会引起发病，属于条件性致病菌[1，2]。有学者报道，肠球菌属菌种有19个，主要有鸟肠球菌（E. avium）、病臭肠球菌（E. malodoratus）、棉子糖肠球菌（E. raffinosus）、粪肠球菌（E. faecalis）、屎肠球菌（E. faecium）、铅黄肠球菌（E. casseliflavus）、蒙氏肠球菌（E. mundtii）、殊异肠球菌（E. dispar）、盲肠肠球菌（E. cecorum）和孤立四联球菌（E. Solitarius）等，至2003年确定的肠球菌属已增至31种[3]。在正常人群中，坚忍肠球菌（E. durans）和海氏肠球菌（E. Hirae）携带率分别为18%和9%。而在家畜中，坚忍肠球菌主要存在于牛及仔鸡中。肠球菌的分布随地区不同而不同，在西班牙临床上主要的肠球菌种为粪肠球菌与屎肠球菌，而在瑞典等国家主要为屎肠球菌和海氏肠球菌。肠球菌一直被认为是非致病性阳性菌存在，临床风险很小，但近年来很多研究发现肠球菌是导致外科伤口、血液、泌尿道、脑膜和血管感染的主要医院病原体[4]，目前，由肠球菌引起的菌血症及心内膜炎已在医院广泛存在，其中粪肠球菌是主要病原体，其次是屎肠球菌，而其他肠球菌种很少见发病。
肠球菌细胞壁较厚，故对多种药物具有天然耐药性，但也更易被诱导产生新的耐药性。近年来，由于抗生素在临床上的广泛使用，肠球菌耐药菌株不断增多。至今万古霉素的耐药菌株已广泛存在，某些抗生素甚至达到完全耐药，且有研究表明，肠球菌携带的耐药基因可在人和动物之间进行传播，给临床治疗带来了很大难题，对动物及人类健康造成了严重威胁。然而，根据武汉马术协会数据显示，历年来武汉马术俱乐部及相关工作人员的数量呈现逐年递增的趋势，这无疑增加了人畜共患病原体的传播风险。由于武汉市马源肠球菌的耐药性调查数据极其缺乏，鉴于此，本研究对武汉马术俱乐部进行随机抽查，对其肠球菌分离和耐药情况进行调查，旨在为当地马匹疾病的防治提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验以武汉市2个马术俱乐部为主要研究对象，分别对42匹温血马匹进行粪便样品采集，于-20 ℃保存。采样时认真记录编号，并调查俱乐部饲养管理、既往病史、役用及用药情况。
1.2 试验方法
1.2.1 肠球菌的分离及初步鉴定 肠球菌的初步分离按照链球菌培养方式进行。样品做预处理后，置于含20%兔血清的营养肉汤中进行培养，过夜后蘸取菌液接种于TSA培养基中，24 h后观察菌落形态。表面扁平、光滑并呈灰白色菌落初步定为可疑菌落，并对可疑菌落进行格兰式染色（阳性球菌）、触酶试验（阴性者为肠球菌）、16 sDNA基因扩增等进行鉴定。
1.2.2 肠球菌耐药性研究 对“1.2.1”中的菌株进行KB纸片扩散试验，结果根据CLSI《美国临床实验室标准化协会》标准进行判定。
2 结果与分析
2.1 分离鉴定结果与分析
对2个马术俱乐部共计42份样本分离出的10个菌株样品分别进行革兰氏染色（图1）、生化试验（表1）和触酶试验鉴定，结果初步鉴定为粪肠球菌，分离率为23.8%。
对初步鉴定为肠球菌菌株再次进行16sDNA PCR扩增（图2），进一步确定为肠球菌。对16s DNA扩增引物测序并进行Blast对比分析，结果见图3。由图3可见，H8样本与粪肠球菌同源性最高。
2.2 耐药性试验结果
将所有分离菌株进行KB纸片扩散试验，结果显示10株肠球菌菌株中有6株为庆大霉素耐药（60%），6株为头孢类抗生素耐药（60%），2株为庆大霉素和头孢类抗生素混合耐药（20%），且据马主陈述，采样之前3个月内均未使用抗生素进行治疗。具体结果见表2和图4。
3 小结与讨论
肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。曾被认为是非致病性共生体，临床风险很小。最近调查显示，肠球菌是引起人类医院感染的第二大革兰氏阳性细菌，是导致手术伤口、尿路、脑膜和心内膜感染的主要医源病原体[5]。肠球菌对低至高水平的几种抗菌素本能具有耐药性，包括内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷类和林可亚胺[6]。医院感染率的增加可部分归因于人类医院大量使用抗菌素和肠球菌耐药（AR）菌株的发展[7]。然而，马源肠球菌研究相当匮乏[8]。
本试验结果显示，武汉市2个马术俱乐部粪肠球菌分离率为23.8%，与韩国赛马管理局统计数据和其他动物如藏猪分离率相比均较低[9]，这可能与本试验采样点局限性有关。 本试验结果说明2个马术俱乐部马源肠球菌耐药率较高，其中庆大霉素和头孢氨苄耐药率均达到60%，而混合耐药率为20%（庆大霉素和头孢氨苄）。本次试验结果耐药率较高，虽可能跟样本数量有关，但仍需引起注意。本次试验结果耐药性与藏猪源肠球菌耐药结果相似[9]，但与韩国马源耐药率（70.6%）相比较低，与葡萄牙部分地区马源肠球菌耐药性相比则较高（8.8%）[10，11]。
綜上所述，这是首次对武汉市马术俱乐部肠球菌进行采样耐药研究。结果显示，肠球菌优势种为粪肠球菌，且耐药性较为严重。通过韩国研究者报道显示，耐药性肠球菌在马之间或马与其环境之间可以传播，这意味着从马传播到人类尤其是成为骑手、马工等马业工作者的潜在风险。因此，笔者后期将继续研究武汉市马源肠球菌与周围环境之间的关系。
参考文献：
[1] FISHER K， PHILLIPS C. The ecology， epidemiology and virulence of Enterococcus[J]. Microbiology， 2009， 155： 1749-1757.
[2] MOHAMED J A， HUANG D B. Biofilm formation by enterococci[J]. J Med Microbioh ，2007， 56： 1581-1588.
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[9] 兰彦芳. 藏猪链球菌2型血清学调查及肠球菌耐药性研究[D].武汉：华中农业大学，2017.
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