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[摘 要]随着抗生素的频繁使用，细菌对它们的适应能力也随之增强，耐药性问题日益严重。自克拉维酸发现以来，其以新颖的结构与功能备受关注，克拉维酸本身的抗菌活性很低，但它对多种β-内酞胺酶的抑制作用却是高效且不可逆的，在与青霉素类或头抱菌素联合使用时，具有较强的协同作用，尤其是对产生耐药性的淋球菌、厌氧菌、流感杆菌、金葡球菌等的协同作用令人注目。我国很早就开始研发克拉维酸，但普遍存在发酵单位低、回收率低等问题，成为制约其生产的瓶颈。目前，我国的制剂所用到的克拉维酸基本都来源于进口，因此，改良克拉维酸产生菌，提高并稳定克拉维酸产量，提高后序工段的回收率，降低生产成本，有着非常广阔的前景。
[关键词]克拉维酸；菌种；选育及；发酵工艺
中图分类号：TQ920 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）42-0301-01
1 克拉维酸的作用机理
克拉维酸的分子结构中除了含有β-内酞胺环外，还有一个哩烷环。克拉维酸主要作用于β-内酞胺酶的丝氨酸位点，β-内酞胺酶一旦与克拉维酸结合后，会使β-内酞胺环开环形成酞化物2，然后哩烷环开环形成酮衍生物3，这些产物可以水解得到活性酶及产物5和6，产物3再转变为p一氨丙烯酸类化合物4后，可进一步反应生成含有插烯氨基甲酸酷结构的不可逆的抑制产物7和8，这些酶结合产物难以水解，致使克拉维酸对β-内酞胺酶产生不可逆的抑制作用，因此能够确保β-内酞胺酶类抗生素的活性。
2 仪器与材料
2.1 仪器与试剂
1100型高效液相色谱仪。带小棒链霉菌SIIA0487（本所菌种保藏中心，1摇瓶发酵单位3760g/ml）。溶菌酶（中国医药集团化学试剂有限公司，生化试剂BR，比活力≥20000u/mg）。
2.2 培养基与缓冲液
斜面及分离培养基/g·L-1：可溶性淀粉20，MgSO4·6H2O0.244，KNO41，FeSO4·7H2O0.01，NaCl0.5，K2HPO4·3H2O0.5，琼脂12；pH7.0。
种子培养基/g·L-1：淀粉12，黄豆粉30，甘油5，酵母粉1，蛋白胨1，KH2PO41，KNO41；pH7.2。发酵培养基/g·L-1：淀粉30，黄豆粉35，酵母粉10，蛋白胨1，谷氨酸钠0.5，苏氨酸1.5，甘油10，KNO41，KH2PO40.8；pH7.6。
菌丝制备培养基（YEME）/g·L-1：酵母粉3，蛋白胨5，麦芽提取物3，葡萄糖10，蔗糖150，调至pH7.2，121℃灭菌20min。使用时加入灭菌后的下述溶液：浓度为2.5mol/L的氯化镁溶液至终浓度5mmol/L，浓度为1g/ml的甘氨酸至终浓度3g/L。
微量元素溶液/mg·L-1：ZnCl240，FeCl2·6H2O200，CuCl2·2H2O10，MnCl2·4H2O10，Na2B4O7·10H2O10，（NH4）6·Mo7O24·4H2O10，后4种试剂单独灭菌，使用时加入。再生培养基（R2YE）/g·L-1：蔗糖103，蛋白胨4，葡萄糖10，酵母抽提物4，胰蛋白胨2，酪蛋白水解物1，K2SO40.25，MgCl2·6H2O10.12，琼脂20，微量元素溶液0.2ml。取上述溶液50ml加入下列溶液：0.5%磷酸二氢钾溶液1ml，3.68%氯化钙溶液8ml，0.25mol/LTris-HCl（pH7.2）10ml，1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，用蒸馏水定容至100ml，最终pH6.5。
P缓冲液：蔗糖103g，K2SO40.25g，MgCl2·6H2O2.02g，微量元素溶液2ml，加水溶解并定容至800ml，调至pH6.8～7.0，121℃灭菌20min，使用前按顺序依次加入以下灭菌溶液：0.5%磷酸二氢钾溶液1ml，3.68%氯化钙溶液10ml，5.37%TES（N-三甲基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH7.2）10ml。
3 方法与结果
3.1 菌种培养
第一，种子培养，对于挖块新鲜斜面培养物接种于种子培养基30ml/250ml摇瓶中，28℃振荡（220r/min）培养32h。第二，发酵培养。取种子液按接种量16%接入发酵培养基30ml/250ml摇瓶中，28℃振荡（220r/min）培养96h。
3.2 方法
对发酵液离心（2200×g）10min，去除菌丝体和固体剩余物。吸取上清液5ml，用重蒸水适当稀释，经0.22m滤膜过滤后进行HPLC检测。色谱条件：色谱柱ODSC18柱（4.6mm×150mm，5m）；流动相甲醇︰水︰10%氢氧化四丁铵（TBA）溶液（30∶75∶2）；流速0.7ml/min；检测波长220nm；柱温25℃；进样量10l。
3.3 制备原生质体
在装有30ml菌丝制备液体培养基的250ml三角瓶中（内装直径约3mm的玻璃珠15粒），28℃振荡（220r/min）培养32h取SIIA0487斜面菌种（约1cm2）进行接种到。吸取菌丝培养液10ml，离心（1700×g）15min，弃去上清液，收集菌丝体。用P缓冲液洗涤菌丝3次，加入适量无菌溶菌酶（浓度为1mg/ml）溶液，混匀，30℃保温酶解。在整个酶解过程中，每隔15min用吸管吹吸一次，使酶充分作用于菌丝。镜检原生质体形成情况，当绝大多數菌体脱去细胞壁，呈现单一的原生质体球时，停止酶解反应。用吸管多次吹吸酶解液使原生质体从菌丝中释放。将此酶解液通过双层无菌擦镜纸过滤，除去未酶解的菌丝片断，取滤液离心（140×g）5min，小心弃去上清液，轻弹离心管壁，直至原生质体分散在残留的液体中，形成奶状悬液。用P缓冲液洗涤离心（140×g，5min）2次，洗净溶菌酶，最后加入P缓冲液，悬浮原生质体。
3.4 高产菌株遗传稳定性以及对苏氨酸耐的观察
对于1高产突变株SIIA0220连续斜面传代至F5，进行摇瓶发酵培养。结果显示，F0～F5的发酵单位分别为5113、5230、5110、5089、4981和4990g/ml，无显著变化，表明该突变株连续传至6代1产量较稳定。将1高产突变株SIIA0220获得的原生质体接种于含不同浓度苏氨酸的再生培养基上培养，观察原生质体生长情况。结果体现出，1高产突变株对苏氨酸的耐受程度比出发菌株有所提高，在含10%苏氨酸的平板上可见少量呈光秃型的小菌落，对苏氨酸的耐受浓度由6%提高到10%。
结语
该试验将苏氨酸加入到再生培养基中，选用原生质体不能生长的苏氨酸浓度作为筛选模型，利用该模型有望选择性提高菌株产物产量的阳性突变率。通过该模型筛选得到的突变株，其代谢途径和代谢流可能发生了变化，从而有望筛选得到1高产突变株。本研究采用上述方法，最终得到了一株遗传性能稳定的1高产突变株SIIA0220，其摇瓶发酵单位达5113g/ml，比原始出发菌株SIIA0487提高约36%。
参考文献
[1] 史毓芳，韩俊茹，王普.克拉维酸高产菌株的选育及发酵工艺研究[J].浙江工业大学学报，2005，（05）：570-575.
[2] 王明林.克拉维酸产生菌的研究[D].沈阳药科大学，2003.
[关键词]克拉维酸；菌种；选育及；发酵工艺
中图分类号：TQ920 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）42-0301-01
1 克拉维酸的作用机理
克拉维酸的分子结构中除了含有β-内酞胺环外，还有一个哩烷环。克拉维酸主要作用于β-内酞胺酶的丝氨酸位点，β-内酞胺酶一旦与克拉维酸结合后，会使β-内酞胺环开环形成酞化物2，然后哩烷环开环形成酮衍生物3，这些产物可以水解得到活性酶及产物5和6，产物3再转变为p一氨丙烯酸类化合物4后，可进一步反应生成含有插烯氨基甲酸酷结构的不可逆的抑制产物7和8，这些酶结合产物难以水解，致使克拉维酸对β-内酞胺酶产生不可逆的抑制作用，因此能够确保β-内酞胺酶类抗生素的活性。
2 仪器与材料
2.1 仪器与试剂
1100型高效液相色谱仪。带小棒链霉菌SIIA0487（本所菌种保藏中心，1摇瓶发酵单位3760g/ml）。溶菌酶（中国医药集团化学试剂有限公司，生化试剂BR，比活力≥20000u/mg）。
2.2 培养基与缓冲液
斜面及分离培养基/g·L-1：可溶性淀粉20，MgSO4·6H2O0.244，KNO41，FeSO4·7H2O0.01，NaCl0.5，K2HPO4·3H2O0.5，琼脂12；pH7.0。
种子培养基/g·L-1：淀粉12，黄豆粉30，甘油5，酵母粉1，蛋白胨1，KH2PO41，KNO41；pH7.2。发酵培养基/g·L-1：淀粉30，黄豆粉35，酵母粉10，蛋白胨1，谷氨酸钠0.5，苏氨酸1.5，甘油10，KNO41，KH2PO40.8；pH7.6。
菌丝制备培养基（YEME）/g·L-1：酵母粉3，蛋白胨5，麦芽提取物3，葡萄糖10，蔗糖150，调至pH7.2，121℃灭菌20min。使用时加入灭菌后的下述溶液：浓度为2.5mol/L的氯化镁溶液至终浓度5mmol/L，浓度为1g/ml的甘氨酸至终浓度3g/L。
微量元素溶液/mg·L-1：ZnCl240，FeCl2·6H2O200，CuCl2·2H2O10，MnCl2·4H2O10，Na2B4O7·10H2O10，（NH4）6·Mo7O24·4H2O10，后4种试剂单独灭菌，使用时加入。再生培养基（R2YE）/g·L-1：蔗糖103，蛋白胨4，葡萄糖10，酵母抽提物4，胰蛋白胨2，酪蛋白水解物1，K2SO40.25，MgCl2·6H2O10.12，琼脂20，微量元素溶液0.2ml。取上述溶液50ml加入下列溶液：0.5%磷酸二氢钾溶液1ml，3.68%氯化钙溶液8ml，0.25mol/LTris-HCl（pH7.2）10ml，1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，用蒸馏水定容至100ml，最终pH6.5。
P缓冲液：蔗糖103g，K2SO40.25g，MgCl2·6H2O2.02g，微量元素溶液2ml，加水溶解并定容至800ml，调至pH6.8～7.0，121℃灭菌20min，使用前按顺序依次加入以下灭菌溶液：0.5%磷酸二氢钾溶液1ml，3.68%氯化钙溶液10ml，5.37%TES（N-三甲基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH7.2）10ml。
3 方法与结果
3.1 菌种培养
第一，种子培养，对于挖块新鲜斜面培养物接种于种子培养基30ml/250ml摇瓶中，28℃振荡（220r/min）培养32h。第二，发酵培养。取种子液按接种量16%接入发酵培养基30ml/250ml摇瓶中，28℃振荡（220r/min）培养96h。
3.2 方法
对发酵液离心（2200×g）10min，去除菌丝体和固体剩余物。吸取上清液5ml，用重蒸水适当稀释，经0.22m滤膜过滤后进行HPLC检测。色谱条件：色谱柱ODSC18柱（4.6mm×150mm，5m）；流动相甲醇︰水︰10%氢氧化四丁铵（TBA）溶液（30∶75∶2）；流速0.7ml/min；检测波长220nm；柱温25℃；进样量10l。
3.3 制备原生质体
在装有30ml菌丝制备液体培养基的250ml三角瓶中（内装直径约3mm的玻璃珠15粒），28℃振荡（220r/min）培养32h取SIIA0487斜面菌种（约1cm2）进行接种到。吸取菌丝培养液10ml，离心（1700×g）15min，弃去上清液，收集菌丝体。用P缓冲液洗涤菌丝3次，加入适量无菌溶菌酶（浓度为1mg/ml）溶液，混匀，30℃保温酶解。在整个酶解过程中，每隔15min用吸管吹吸一次，使酶充分作用于菌丝。镜检原生质体形成情况，当绝大多數菌体脱去细胞壁，呈现单一的原生质体球时，停止酶解反应。用吸管多次吹吸酶解液使原生质体从菌丝中释放。将此酶解液通过双层无菌擦镜纸过滤，除去未酶解的菌丝片断，取滤液离心（140×g）5min，小心弃去上清液，轻弹离心管壁，直至原生质体分散在残留的液体中，形成奶状悬液。用P缓冲液洗涤离心（140×g，5min）2次，洗净溶菌酶，最后加入P缓冲液，悬浮原生质体。
3.4 高产菌株遗传稳定性以及对苏氨酸耐的观察
对于1高产突变株SIIA0220连续斜面传代至F5，进行摇瓶发酵培养。结果显示，F0～F5的发酵单位分别为5113、5230、5110、5089、4981和4990g/ml，无显著变化，表明该突变株连续传至6代1产量较稳定。将1高产突变株SIIA0220获得的原生质体接种于含不同浓度苏氨酸的再生培养基上培养，观察原生质体生长情况。结果体现出，1高产突变株对苏氨酸的耐受程度比出发菌株有所提高，在含10%苏氨酸的平板上可见少量呈光秃型的小菌落，对苏氨酸的耐受浓度由6%提高到10%。
结语
该试验将苏氨酸加入到再生培养基中，选用原生质体不能生长的苏氨酸浓度作为筛选模型，利用该模型有望选择性提高菌株产物产量的阳性突变率。通过该模型筛选得到的突变株，其代谢途径和代谢流可能发生了变化，从而有望筛选得到1高产突变株。本研究采用上述方法，最终得到了一株遗传性能稳定的1高产突变株SIIA0220，其摇瓶发酵单位达5113g/ml，比原始出发菌株SIIA0487提高约36%。
参考文献
[1] 史毓芳，韩俊茹，王普.克拉维酸高产菌株的选育及发酵工艺研究[J].浙江工业大学学报，2005，（05）：570-575.
[2] 王明林.克拉维酸产生菌的研究[D].沈阳药科大学，2003.