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中图分类号：R593.22 文献标识码：B 文章编号：1004-7484（2010）12-0296-03
类风湿关节炎（RA）是以多关节滑膜慢性炎症导致滑膜成纤维母细胞增生、大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见自身免疫性疾病。研究发现，淋巴细胞活性及其信息传递异常与RA的发生密切相关。我们采用流式细胞仪分析RA患者外周血和关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子CD28／B7（CD80或CD86）、CDl54（CD40L）／CD40和淋巴细胞活化标志CD25、人白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达，以探讨这些指标在BA诊断和治疗中的应用价值。
1对象和方法
1.1对象：30例RA患者，女24例，男6例，年龄27~65岁，均符合1987，年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准，健康献血者20名，女16名，男4名，年龄23~55岁。均抽取空腹静脉血2ml，经EDTA-K2抗凝备用。另20例RA患者的关节滑膜液取自齐齐哈尔医学院附属第三医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术者，女15例，男5例，年龄23~41岁。对照组的关节滑膜液取自因外伤截肢的10名正常人，两组年龄、性别差异无统计学意义。
1.2关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子和淋巴细胞活化标志的表达：均采用双色荧光标记，分别和100 µl 1×106/ml细胞数的关节滑膜液充分混匀，室温暗处反应15min，加0.5 ml PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.3流式细胞分析：FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）开机后以CaliBRITE 3荧光微球和FACSComp自动软件检查仪器灵敏度，并自动设定试验获取条件，包括光电倍增管（PMT）电压和荧光补偿等。用CellQuest软件对样本试验获取条件作进一步优化，并检测各组样本管，获取10000个细胞后，用Cell Quest软件分析各CD分子在淋巴细胞中免疫荧光阳性细胞的百分率。
1.4关节滑膜液淋巴细胞分离：关节滑膜液用20 1U/ml肝素抗凝，3 000r/min离心10min，弃上清液，淀物加PBS重悬，用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离制备淋巴细胞（1 500r/min离心15 min），调整细胞浓度至1×106/ml，用于流式细胞仪检测，6h内完成。
1.5外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：采用双色荧光染色，在FALCON试管（美国BD公司）中加入20µl异硫氰基荧光素（FITC）标记的抗CD3单抗，藻红蛋白（PE）标记的抗CD28单抗或抗CDl54（CD40L）单抗。同样在FALCON试管中加20µ1 FITC标记的抗CDl9单抗，PE标记的抗CD80单抗或抗CD86单抗或抗CD40单抗及双色同型对照免疫球蛋白（均为美国BD公司产品），分别与100µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min。加1×FACS溶血素（美国BD公司）2m1，充分混匀，室温暗处反应10min。1 000r/min离心5 min，弃上清液，加PBS 2 m1，充分混匀。1 000r/min离心5min，弃上清液，加0.5血PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.6外周血淋巴细胞活化标志的表达：采用三色荧光染色，在FALCON试管中加入20 µl FITC标记的抗CDl9单抗、PE标记的抗CD25单抗或抗HLA-DR单抗及叶绿素蛋白（Percp）标记的抗CD3单抗和三色同型对照免疫球蛋白（均为美国BD公司产品），分别和100 µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min，其余操作同方法3。
1.7统计学处理：所测数据以±s表示，统计分析采用SPSSl0.0软件，各组均数比较采用t检验。
2结果
2.1外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者外周血中，T淋巴细胞CD25表达阳性率和B淋巴细胞CD25表达阳性率与正常对照组比均明显增多（p<0.01），T淋巴细胞和B淋巴细胞的HLA-DR表达阳性率与正常对照组比差异均无统计学意义（p>0.05）。见表1。
表1RA患者外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达（±S，%）
T淋巴细胞 B淋巴细胞
组别 例数 CD3+ CD3+ CD19+ CD19+
CD25+ HLA-DR+ CD25+ HLA-DR+
RA组 30 8.2±2.5* 20.2±12.5 2.6±1.1* 15.8±7.3
对照组 20 4.7±1.4 15.7±6.5 0.9±0.6 13.4±2.4
注：*与对照组比较P<0.01
2.2关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者关节滑膜液中，T淋巴细胞HLA-DR表达阳性率明显增多（P<0.01），而CD25表达阳性率与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；但B淋巴细胞HLA-DR和CD25表达阳性率明显增多（P<0.01）表2。
表2RA患者关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达（±s，%）
T淋巴细胞 B淋巴细胞
组别 例数 CD3+ CD3+ CD19+ CD19+
CD25+ HLA-DR+ CD25+ HLA-DR+
RA组 20 0.3±0. 26.5±1.2* 0.5±0.2* 13.9±1.9*
对照组 10 0.1±0.1 6.5±1.2* 0.1±0.0 10.0±1.3
注：*与对照组比较P<0.01
2.3外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：RA患者外周血中，B淋巴细胞CD86表达阳性率（1.9%±10.9%）与正常对照组（6.1%±2.3%）相比明显下降（P<0.01），同时B淋巴细胞CD40表达阳性率（17.3%±7.7%）比正常对照组（12.4%±3.1%）明显增多（P<0.05）；而B淋巴细胞CD80表达阳性率（2.4%±0.9%）与正常对照组（2.0%土0.8%）相比差异无统计学意义（P>0.05），见图1。T淋巴细胞CD28、CD154表达阳性率（48.8%±8.8%和0.2%土0.1%）与正常对照组（48.8%土5.8%和0.2%土0.2%）相比差异也无统计学意义（p>0.05）。
图1类风湿关节炎患者外周血B淋巴细胞共刺激分子CD80、CD86和CD40的表达
2.4关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子的表达：RA患者关节滑膜液中B淋巴细胞CD80、CD86和CD40表达阳性率（0.4%±0.2%、1.3%±0.8%和0.6%±0.3%）与正常对照组（0.3%±0.2%、3.6%土2.4%和0.4%±0.4%）相比差异无统计学意义（P>0.05）。RA患者组T淋巴细胞CD28、CDl54表达阳性率（8.0%±2.0%和0.4%±0.2%）与正常对照组（7.2%+2.6%和0.4%土0.1%）相比，差异亦无统计学意义（p>0.05）。
3讨论
Kuchroo等报道，虽然CD80和CD86对T细胞的增生都提供协同刺激作用，但CD80可激发Thl型细胞反应，而CD86则激发Th2型细胞反应。Kitagawa等认为，CD40与CDl54的相互作用可上调RA患者体内白细胞介素12的水平，从而促使Thl细胞分泌细胞因子明显增多，最终导致Thl/Th2细胞分泌的细胞因子失衡。在本研究中，RA患者外周血B淋巴细胞CD86表达比正常对照组明显减少，B淋巴细胞CD40表达比正常对照组明显增多，表明RA患者存在淋巴细胞协同刺激分子的异常表达，这些淋巴细胞协同刺激信号传导异常可能与RA患者体内Th2细胞分泌的细胞因子水平明显下降，Thl细胞分泌的细胞因子水平升高，Thl/Th2细胞分泌的细胞因子失衡密切相关。
CD25和HLA-DR是细胞活化的标志。在本试验中，RA患者外周血T、B淋巴细胞CD25表达与正常对照组相比均明显增多，关节滑膜液B淋巴细胞CD25表达和T、B淋巴细胞HLA-DR表达与正常对照组相比亦明显增多，表明RA患者在外周血和关节滑膜液中均有活化的T、B淋巴细胞明显增多现象。但对RA不同时期的免疫活性细胞的活化程度问题，还需进一步研究确定。
在免疫反应中，CD86介导的协同刺激作用是激发T细胞反应的关键，而CD80介导的协同刺激作用可能可维持和扩展T细胞反应的进行。免疫活性细胞的增多表明RA患者局部和全身免疫功能亢进。淋巴细胞被激活主要依靠协同刺激分子及其相应的配体，在诱导胸腺依赖抗原（TD-Ag）特异性免疫应答中，协同刺激信号CD28/B7（CD80或CD86）是T细胞活化的重要因素，在免疫反应中起着关键作用；协同刺激信号CDl54（CD40L）/CD40参与B细胞的应答，亦参与T细胞依赖抗原（TD-Ag）诱发的免疫应答。协同刺激信号在调节淋巴细胞亚群分化中起着重要作用虽然，RA的发病机制至今不明，但是研究淋巴细胞活化及其信号传导异常，进而改变细胞信号异常传递、平衡促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的分泌，阻断淋巴细胞的过度激活机制，将为临床诊断和治疗RA提供新的路径。
参考文献
[1] Skapenko A, Lip sky PE, Kraetsch HG, et al. Antigen-independentTh2 cell differentiation by stimulation of CD28: regulation via IL-4 gene expression and mitogen-activated protein kinas activation.JImmunol, 2001, 166:4283-4296.
[2] Caruso A, Licenziati S, Corulli M, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry, 1997, 27:71-76.
[3] Salomon B, Bluestone JA. Complexities ofCD28/BT:CTLA-4costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. A nnuRev Immunol, 2001, 19:225-252.
[4] 冷建杭，蒋群芳，姜晓虹，等.类风湿关节炎血清和滑液Thl/Th2细胞因子的水平及意义[J].浙江临床医学，2004，6：457-458.
类风湿关节炎（RA）是以多关节滑膜慢性炎症导致滑膜成纤维母细胞增生、大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见自身免疫性疾病。研究发现，淋巴细胞活性及其信息传递异常与RA的发生密切相关。我们采用流式细胞仪分析RA患者外周血和关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子CD28／B7（CD80或CD86）、CDl54（CD40L）／CD40和淋巴细胞活化标志CD25、人白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达，以探讨这些指标在BA诊断和治疗中的应用价值。
1对象和方法
1.1对象：30例RA患者，女24例，男6例，年龄27~65岁，均符合1987，年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准，健康献血者20名，女16名，男4名，年龄23~55岁。均抽取空腹静脉血2ml，经EDTA-K2抗凝备用。另20例RA患者的关节滑膜液取自齐齐哈尔医学院附属第三医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术者，女15例，男5例，年龄23~41岁。对照组的关节滑膜液取自因外伤截肢的10名正常人，两组年龄、性别差异无统计学意义。
1.2关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子和淋巴细胞活化标志的表达：均采用双色荧光标记，分别和100 µl 1×106/ml细胞数的关节滑膜液充分混匀，室温暗处反应15min，加0.5 ml PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.3流式细胞分析：FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）开机后以CaliBRITE 3荧光微球和FACSComp自动软件检查仪器灵敏度，并自动设定试验获取条件，包括光电倍增管（PMT）电压和荧光补偿等。用CellQuest软件对样本试验获取条件作进一步优化，并检测各组样本管，获取10000个细胞后，用Cell Quest软件分析各CD分子在淋巴细胞中免疫荧光阳性细胞的百分率。
1.4关节滑膜液淋巴细胞分离：关节滑膜液用20 1U/ml肝素抗凝，3 000r/min离心10min，弃上清液，淀物加PBS重悬，用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离制备淋巴细胞（1 500r/min离心15 min），调整细胞浓度至1×106/ml，用于流式细胞仪检测，6h内完成。
1.5外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：采用双色荧光染色，在FALCON试管（美国BD公司）中加入20µl异硫氰基荧光素（FITC）标记的抗CD3单抗，藻红蛋白（PE）标记的抗CD28单抗或抗CDl54（CD40L）单抗。同样在FALCON试管中加20µ1 FITC标记的抗CDl9单抗，PE标记的抗CD80单抗或抗CD86单抗或抗CD40单抗及双色同型对照免疫球蛋白（均为美国BD公司产品），分别与100µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min。加1×FACS溶血素（美国BD公司）2m1，充分混匀，室温暗处反应10min。1 000r/min离心5 min，弃上清液，加PBS 2 m1，充分混匀。1 000r/min离心5min，弃上清液，加0.5血PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.6外周血淋巴细胞活化标志的表达：采用三色荧光染色，在FALCON试管中加入20 µl FITC标记的抗CDl9单抗、PE标记的抗CD25单抗或抗HLA-DR单抗及叶绿素蛋白（Percp）标记的抗CD3单抗和三色同型对照免疫球蛋白（均为美国BD公司产品），分别和100 µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min，其余操作同方法3。
1.7统计学处理：所测数据以±s表示，统计分析采用SPSSl0.0软件，各组均数比较采用t检验。
2结果
2.1外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者外周血中，T淋巴细胞CD25表达阳性率和B淋巴细胞CD25表达阳性率与正常对照组比均明显增多（p<0.01），T淋巴细胞和B淋巴细胞的HLA-DR表达阳性率与正常对照组比差异均无统计学意义（p>0.05）。见表1。
表1RA患者外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达（±S，%）
T淋巴细胞 B淋巴细胞
组别 例数 CD3+ CD3+ CD19+ CD19+
CD25+ HLA-DR+ CD25+ HLA-DR+
RA组 30 8.2±2.5* 20.2±12.5 2.6±1.1* 15.8±7.3
对照组 20 4.7±1.4 15.7±6.5 0.9±0.6 13.4±2.4
注：*与对照组比较P<0.01
2.2关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者关节滑膜液中，T淋巴细胞HLA-DR表达阳性率明显增多（P<0.01），而CD25表达阳性率与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；但B淋巴细胞HLA-DR和CD25表达阳性率明显增多（P<0.01）表2。
表2RA患者关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达（±s，%）
T淋巴细胞 B淋巴细胞
组别 例数 CD3+ CD3+ CD19+ CD19+
CD25+ HLA-DR+ CD25+ HLA-DR+
RA组 20 0.3±0. 26.5±1.2* 0.5±0.2* 13.9±1.9*
对照组 10 0.1±0.1 6.5±1.2* 0.1±0.0 10.0±1.3
注：*与对照组比较P<0.01
2.3外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：RA患者外周血中，B淋巴细胞CD86表达阳性率（1.9%±10.9%）与正常对照组（6.1%±2.3%）相比明显下降（P<0.01），同时B淋巴细胞CD40表达阳性率（17.3%±7.7%）比正常对照组（12.4%±3.1%）明显增多（P<0.05）；而B淋巴细胞CD80表达阳性率（2.4%±0.9%）与正常对照组（2.0%土0.8%）相比差异无统计学意义（P>0.05），见图1。T淋巴细胞CD28、CD154表达阳性率（48.8%±8.8%和0.2%土0.1%）与正常对照组（48.8%土5.8%和0.2%土0.2%）相比差异也无统计学意义（p>0.05）。
图1类风湿关节炎患者外周血B淋巴细胞共刺激分子CD80、CD86和CD40的表达
2.4关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子的表达：RA患者关节滑膜液中B淋巴细胞CD80、CD86和CD40表达阳性率（0.4%±0.2%、1.3%±0.8%和0.6%±0.3%）与正常对照组（0.3%±0.2%、3.6%土2.4%和0.4%±0.4%）相比差异无统计学意义（P>0.05）。RA患者组T淋巴细胞CD28、CDl54表达阳性率（8.0%±2.0%和0.4%±0.2%）与正常对照组（7.2%+2.6%和0.4%土0.1%）相比，差异亦无统计学意义（p>0.05）。
3讨论
Kuchroo等报道，虽然CD80和CD86对T细胞的增生都提供协同刺激作用，但CD80可激发Thl型细胞反应，而CD86则激发Th2型细胞反应。Kitagawa等认为，CD40与CDl54的相互作用可上调RA患者体内白细胞介素12的水平，从而促使Thl细胞分泌细胞因子明显增多，最终导致Thl/Th2细胞分泌的细胞因子失衡。在本研究中，RA患者外周血B淋巴细胞CD86表达比正常对照组明显减少，B淋巴细胞CD40表达比正常对照组明显增多，表明RA患者存在淋巴细胞协同刺激分子的异常表达，这些淋巴细胞协同刺激信号传导异常可能与RA患者体内Th2细胞分泌的细胞因子水平明显下降，Thl细胞分泌的细胞因子水平升高，Thl/Th2细胞分泌的细胞因子失衡密切相关。
CD25和HLA-DR是细胞活化的标志。在本试验中，RA患者外周血T、B淋巴细胞CD25表达与正常对照组相比均明显增多，关节滑膜液B淋巴细胞CD25表达和T、B淋巴细胞HLA-DR表达与正常对照组相比亦明显增多，表明RA患者在外周血和关节滑膜液中均有活化的T、B淋巴细胞明显增多现象。但对RA不同时期的免疫活性细胞的活化程度问题，还需进一步研究确定。
在免疫反应中，CD86介导的协同刺激作用是激发T细胞反应的关键，而CD80介导的协同刺激作用可能可维持和扩展T细胞反应的进行。免疫活性细胞的增多表明RA患者局部和全身免疫功能亢进。淋巴细胞被激活主要依靠协同刺激分子及其相应的配体，在诱导胸腺依赖抗原（TD-Ag）特异性免疫应答中，协同刺激信号CD28/B7（CD80或CD86）是T细胞活化的重要因素，在免疫反应中起着关键作用；协同刺激信号CDl54（CD40L）/CD40参与B细胞的应答，亦参与T细胞依赖抗原（TD-Ag）诱发的免疫应答。协同刺激信号在调节淋巴细胞亚群分化中起着重要作用虽然，RA的发病机制至今不明，但是研究淋巴细胞活化及其信号传导异常，进而改变细胞信号异常传递、平衡促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的分泌，阻断淋巴细胞的过度激活机制，将为临床诊断和治疗RA提供新的路径。
参考文献
[1] Skapenko A, Lip sky PE, Kraetsch HG, et al. Antigen-independentTh2 cell differentiation by stimulation of CD28: regulation via IL-4 gene expression and mitogen-activated protein kinas activation.JImmunol, 2001, 166:4283-4296.
[2] Caruso A, Licenziati S, Corulli M, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry, 1997, 27:71-76.
[3] Salomon B, Bluestone JA. Complexities ofCD28/BT:CTLA-4costimulatory pathways in autoimmunity and transplantation. A nnuRev Immunol, 2001, 19:225-252.
[4] 冷建杭，蒋群芳，姜晓虹，等.类风湿关节炎血清和滑液Thl/Th2细胞因子的水平及意义[J].浙江临床医学，2004，6：457-458.