【摘 要】
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目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA(shRNA)表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤(RB)细胞中VEGF表达的作用.方法 构建VEGF shRNA表达质粒p4.1CMV-VEGF shRNA,以脂质体介
【机 构】
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上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科,上海交通大学医学院附属第九人民医院基础医学院生化教研室
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目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA(shRNA)表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤(RB)细胞中VEGF表达的作用.方法 构建VEGF shRNA表达质粒p4.1CMV-VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO-RB50和HXO-RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4.1CMV-VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4.1CMV-VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附(ELISA)法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4.1CMV-Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照.结果 成功构建p4.1CMV-VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆.阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5.02倍和6.32倍;阴性对照组和空白对照组HXO-RB44细胞分别为实验组的5.70倍和4.86倍.实验组SO-RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为(187.69±83.89)μg/L,显著低于阴性对照组(822.98±187.98)μg/L和空白对照组(865.76±170.33)μg/L,差异有统计学意义(均P＜0.01);实验组HXO-RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为(162.20±66.33)μg/L,与阴性对照组(764.33±164.79)μg/L和空白对照组(828.22±145.94)μg/L比较,差异也有统计学意义(均P＜0.01).结论 VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段.
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