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摘要[目的]利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原。[方法]利用阴离子交换树脂制备高纯度的FMDV抗原，通过对样品及缓冲液pH、流速、缓冲液的盐浓度、样品上样体积等条件的摸索，确定最佳的FMDV抗原洗脱条件。[结果]当缓冲液pH为8.0、流速1.2 mL/min、盐浓度450 mmol/L、上样体积1.5 mL时，FMDV抗原的纯化效果最佳。[结论]该研究结果可为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化提供依据。
关键词阴离子交换树脂；口蹄疫病毒抗原；纯化
中图分类号S859文献标识码A文章编号0517-6611（2016）22-138-02
Abstract[Objective] The aim was to separate and purify FMDV antigen by using ion exchange chromatography. [Method] High purity FMDV antigen was prepared by anion exchange resin， through exploration on sample， buffer solution pH， current speed， salt concentration， loading volume of sample， the optimal elution condition of FMDV antigen was determined. [Result] The best condition for purification of FMDV antigen is when buffer pH reached 8.0， flowed at a speed of about 1.2 mL/min， salt concentration was 450 mmol/L and the loading volume of sample was 1.5 mL. [Conclusion] The results can provide basis for separation and purification of FMDV antigen by ion exchange chromatography.
Key wordsAnion exchange resin； Foot and mouth disease virus antigen； Purification
口蹄疫（Food and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Food and mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄类动物的急性、热性、接触性、烈性传染病。由于该病的发生会造成巨大的经济损失和政治影响，因此，口蹄疫的防治工作始终受到世界各国政府的高度重视[1]。目前，针对该病的防治主要采用灭活疫苗免疫接种，灭活疫苗一般都是由完整病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，其效力与抗原含量、病原体的免疫原性及使用的佐剂有关。由于FMDV本身抗原性较差，病毒灭活后对其抗原性的影响较大，所以在生产口蹄疫灭活疫苗时，尤其是多价疫苗，如何保证单位使用剂量内抗原含量就成为关键问题。层析技术是近代生物化学最常用的方法之一[2]，其中离子交换层析（Ion exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法[3-5]。当蛋白质处于不同的 pH时，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，结合的蛋白通过逐步增加洗脱液的盐浓度或提高洗脱液的 pH将从层析柱上洗脱下来。笔者从缓冲液pH、盐浓度、洗脱流速和上样体积方面对FMDV抗原进行分离与纯化，旨在为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化的应用提供基础资料。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
1.1.1主要试剂。
717离子交换树脂，购自广东西陇化工厂（汕头）；Tris-NaCl缓冲液：10 mmol/L Tris + 300 mmol/L NaCl，将pH分别调至7.0、7.5和8.0。
1.1.2仪器。
Agilent紫外检测仪；酶标仪（美国Thermo）；pH计（Mettler）。
1.2样品来源与前处理
由中农威特生物科技股份有限公司提供口蹄疫病毒灭活抗原，通过超滤浓缩的方法使样品浓缩10倍，备用。
1.3树脂的预处理
将阴离子交换树脂反复用蒸馏水浸泡至蒸馏水无色，再分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH交替浸泡3次，用蒸馏水洗至中性。
1.4离子交换层析
1.4.1装柱。
将阴离子交换树脂装入内径为20 mm的玻璃柱，树脂层高度600 mm，用蒸馏水将树脂冲洗至中性，再用柱体积2倍的起始缓冲液将阴离子交换树脂平衡。
1.4.2紫外检测仪连接。
将阴离子交换树脂连接到紫外检测仪上，将平衡好的树脂在恒定的操作温度下选用不同流速通过蠕动泵流过柱，加入一定量经处理的浓缩样品，流出液通过紫外监测仪连续测量溶液中抗原含量，将测量信号输入记录仪，记录流出液中蛋白浓度随流出时间的变化，用不同浓度的NaCl溶液将目的抗原脱附下来。
1.5分析方法
吸附平衡和洗脱平衡试验中，FMDV浓度的测定采用紫外分光光度法，测定溶液在波长280 nm处的吸光度，根据标准曲线计算实际浓度。FMDV浓缩粗品和层析分离后样品的纯度，通过146S检测、夹心ELISA方法、蛋白检测对比抗原纯化效果。
2结果与分析 2.1进样量对FMDV抗原的分离效果的影响
在树脂高度 600 mm条件下，以 1.5、2.0、3.0 mL 的样品进样体积进行洗脱。由表1可知，当进样体积为 1.5 mL时，FMDV抗原的效价检测和146S检测值均明显高于进样体积为2.0和3.0 mL时，达到最好的分离纯化效果。随着进样体积的增大，抗原中各组分的峰值也相应增大，但是由于树脂的吸附能力已经饱和，过多的进样量不能完全地吸附和洗脱，因此FMDV抗原含量也有所下降。因此，选择1.5 mL作为进样体积。
2.2洗脱液流速对FMDV抗原分离效果的影响
取浓缩抗原样1.5 mL，在树脂高度为 600 mm、分别以 1.0、1.2、1.5 mL/min 的流速进行洗脱分离。通过检测层析后所收集样品的抗原效价、蛋白含量和146S含量，以1.2 mL/min的流速洗脱时，检测结果更好（表2）。由此可见，流速为1.2 mL/min时FMDV抗原的分离效果较好。
2.3缓冲液pH对FMDV抗原分离效果的影响
离子交换层析FMDV抗原时，pH的高低对FMDV抗原的分离效果也有一定的影响，取浓缩抗原样1.5 mL，在树脂高度为 600 mm、流速为 1.2 mL/min 的条件下，缓冲液pH分别为7.0、7.5、8.0条件下进行洗脱。由表3可知，在缓冲液pH为8.0时，FMDV抗原的分离效果较好。
2.4盐浓度对FMDV抗原分离效果的影响
采用逐步提高平衡缓冲液中氯化钠的浓度尽可能使目的抗原与杂蛋白充分分离，从而使FMDV抗原分离效果更好。在树脂高度为 600 mm、上样体积1.5 mL、1.2 mL/min 的洗脱流速和缓冲液pH 8.0的条件下，分别用盐浓度为100、150、450、600 mmol/L进行逐步洗脱，比较经检测所收集峰值的样品蛋白含量和146S含量，发现当缓冲液含盐浓度为450 mmol/L时对FMDV抗原的分离效果较好（表4）。
3讨论与结论
病毒的纯化工艺是疫苗制备中的关键技术，也是直接影
响疫苗质量最重要的一个环节。早先的一般用于动物的病毒性疫苗含有来源于动物组织、细胞和培养液的蛋白质等杂质成分，易使接种者产生过敏等不良反应[6-7]。通过采用纯化技术对疫苗的免疫活性成分（如全病毒或病毒中具有免疫保护作用的亚单位成分）进行纯化与分离，去除部分或大部分生物源性杂质成分（如动物组织、细胞基质和培养基中的杂蛋白、糖类、脂类及核酸等），浓缩富集了有保护或辅助治疗作用的抗原成分，避免或降低了疫苗接种后的副反应发生率，使得纯化病毒疫苗比传统粗制疫苗更加安全[8-9]。
离子交换色谱具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入并迅速扩散，多孔，吸附容量大，同时具有亲水性，对大分子吸附不牢固，用温和的条件可以洗脱，不会引起蛋白质变性，该技术已经被广泛应用于蛋白质、酶、核酸和多糖的分离纯化并获得了较理想的结果，是一种高效的蛋白质纯化方法[10]。在应用时需要考虑多方面的因素，如离子交换剂和缓冲液的性质、离子强度、pH等。同种电荷的不同离子交换剂侧链基团具有不同的pKa，固定条件下对蛋白质有不同大小的结合能力，因此有强弱之分，强离子交换剂能有效结合蛋白质，减少蛋白质的损失，但洗脱时需要较高的盐浓度，或大幅度改变pH[11]。笔者采用阴离子交换层析方法对FMDV进行纯化，确定了较理想的上样量、上样流速、平衡和过柱缓冲液的pH和盐浓度等影响层析纯化效果的参数，为口蹄疫病毒灭活疫苗纯化工艺的建立提供了参考。
参考文献
[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.
[2] 陈来同，唐运.生物化学产品制备技术[M].北京：科学技术文献出版社，2003.
[3] 王雪，宋长征.离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化[J].中国生物工程杂志，2004，24（1）：77-80.
[4] COOPERMAN L，MICHAELI D.The immunogenicity of injectable collagen.I.A 1year prospective study[J].J Am Acad Dermatol，1984，10（4）：638-646.
[5] 姜维，黄强，扶雄.离子交换层析法分离纯化低聚糖研究[J].粮食与油脂，2011（11）：48-50.
[6] 朱家文，武斌，陈葵，等.离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白[J].华东理工大学学报，2002，28（4）：341-345.
[7] JIANG B，WANG Y，SALUZZO J F，et al.Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice [J].Hum Vaccin，2008，4（2）：143-147.
[8] KUNDU A，CRAMAER S M.Lowmolecularweight displacers for highresolution protein separations[J].Anal Biochem，1997，248（1）：111-116.
[9] PEIXOTO C，SOUSA M F，SILVA A C，et al.Downstream processing of triple layered rotavirus like particles[J].J Biotechnol，2007，127（3）：452-461.
[10] WOZNEY J M.Overview of bone morphogenetic proteins[J].Spine，2002，27（16S）：2-8.
[11] 朱厚础.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].北京：科学出版社，1999：40-41.
关键词阴离子交换树脂；口蹄疫病毒抗原；纯化
中图分类号S859文献标识码A文章编号0517-6611（2016）22-138-02
Abstract[Objective] The aim was to separate and purify FMDV antigen by using ion exchange chromatography. [Method] High purity FMDV antigen was prepared by anion exchange resin， through exploration on sample， buffer solution pH， current speed， salt concentration， loading volume of sample， the optimal elution condition of FMDV antigen was determined. [Result] The best condition for purification of FMDV antigen is when buffer pH reached 8.0， flowed at a speed of about 1.2 mL/min， salt concentration was 450 mmol/L and the loading volume of sample was 1.5 mL. [Conclusion] The results can provide basis for separation and purification of FMDV antigen by ion exchange chromatography.
Key wordsAnion exchange resin； Foot and mouth disease virus antigen； Purification
口蹄疫（Food and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Food and mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄类动物的急性、热性、接触性、烈性传染病。由于该病的发生会造成巨大的经济损失和政治影响，因此，口蹄疫的防治工作始终受到世界各国政府的高度重视[1]。目前，针对该病的防治主要采用灭活疫苗免疫接种，灭活疫苗一般都是由完整病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，其效力与抗原含量、病原体的免疫原性及使用的佐剂有关。由于FMDV本身抗原性较差，病毒灭活后对其抗原性的影响较大，所以在生产口蹄疫灭活疫苗时，尤其是多价疫苗，如何保证单位使用剂量内抗原含量就成为关键问题。层析技术是近代生物化学最常用的方法之一[2]，其中离子交换层析（Ion exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法[3-5]。当蛋白质处于不同的 pH时，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，结合的蛋白通过逐步增加洗脱液的盐浓度或提高洗脱液的 pH将从层析柱上洗脱下来。笔者从缓冲液pH、盐浓度、洗脱流速和上样体积方面对FMDV抗原进行分离与纯化，旨在为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化的应用提供基础资料。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
1.1.1主要试剂。
717离子交换树脂，购自广东西陇化工厂（汕头）；Tris-NaCl缓冲液：10 mmol/L Tris + 300 mmol/L NaCl，将pH分别调至7.0、7.5和8.0。
1.1.2仪器。
Agilent紫外检测仪；酶标仪（美国Thermo）；pH计（Mettler）。
1.2样品来源与前处理
由中农威特生物科技股份有限公司提供口蹄疫病毒灭活抗原，通过超滤浓缩的方法使样品浓缩10倍，备用。
1.3树脂的预处理
将阴离子交换树脂反复用蒸馏水浸泡至蒸馏水无色，再分别用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH交替浸泡3次，用蒸馏水洗至中性。
1.4离子交换层析
1.4.1装柱。
将阴离子交换树脂装入内径为20 mm的玻璃柱，树脂层高度600 mm，用蒸馏水将树脂冲洗至中性，再用柱体积2倍的起始缓冲液将阴离子交换树脂平衡。
1.4.2紫外检测仪连接。
将阴离子交换树脂连接到紫外检测仪上，将平衡好的树脂在恒定的操作温度下选用不同流速通过蠕动泵流过柱，加入一定量经处理的浓缩样品，流出液通过紫外监测仪连续测量溶液中抗原含量，将测量信号输入记录仪，记录流出液中蛋白浓度随流出时间的变化，用不同浓度的NaCl溶液将目的抗原脱附下来。
1.5分析方法
吸附平衡和洗脱平衡试验中，FMDV浓度的测定采用紫外分光光度法，测定溶液在波长280 nm处的吸光度，根据标准曲线计算实际浓度。FMDV浓缩粗品和层析分离后样品的纯度，通过146S检测、夹心ELISA方法、蛋白检测对比抗原纯化效果。
2结果与分析 2.1进样量对FMDV抗原的分离效果的影响
在树脂高度 600 mm条件下，以 1.5、2.0、3.0 mL 的样品进样体积进行洗脱。由表1可知，当进样体积为 1.5 mL时，FMDV抗原的效价检测和146S检测值均明显高于进样体积为2.0和3.0 mL时，达到最好的分离纯化效果。随着进样体积的增大，抗原中各组分的峰值也相应增大，但是由于树脂的吸附能力已经饱和，过多的进样量不能完全地吸附和洗脱，因此FMDV抗原含量也有所下降。因此，选择1.5 mL作为进样体积。
2.2洗脱液流速对FMDV抗原分离效果的影响
取浓缩抗原样1.5 mL，在树脂高度为 600 mm、分别以 1.0、1.2、1.5 mL/min 的流速进行洗脱分离。通过检测层析后所收集样品的抗原效价、蛋白含量和146S含量，以1.2 mL/min的流速洗脱时，检测结果更好（表2）。由此可见，流速为1.2 mL/min时FMDV抗原的分离效果较好。
2.3缓冲液pH对FMDV抗原分离效果的影响
离子交换层析FMDV抗原时，pH的高低对FMDV抗原的分离效果也有一定的影响，取浓缩抗原样1.5 mL，在树脂高度为 600 mm、流速为 1.2 mL/min 的条件下，缓冲液pH分别为7.0、7.5、8.0条件下进行洗脱。由表3可知，在缓冲液pH为8.0时，FMDV抗原的分离效果较好。
2.4盐浓度对FMDV抗原分离效果的影响
采用逐步提高平衡缓冲液中氯化钠的浓度尽可能使目的抗原与杂蛋白充分分离，从而使FMDV抗原分离效果更好。在树脂高度为 600 mm、上样体积1.5 mL、1.2 mL/min 的洗脱流速和缓冲液pH 8.0的条件下，分别用盐浓度为100、150、450、600 mmol/L进行逐步洗脱，比较经检测所收集峰值的样品蛋白含量和146S含量，发现当缓冲液含盐浓度为450 mmol/L时对FMDV抗原的分离效果较好（表4）。
3讨论与结论
病毒的纯化工艺是疫苗制备中的关键技术，也是直接影
响疫苗质量最重要的一个环节。早先的一般用于动物的病毒性疫苗含有来源于动物组织、细胞和培养液的蛋白质等杂质成分，易使接种者产生过敏等不良反应[6-7]。通过采用纯化技术对疫苗的免疫活性成分（如全病毒或病毒中具有免疫保护作用的亚单位成分）进行纯化与分离，去除部分或大部分生物源性杂质成分（如动物组织、细胞基质和培养基中的杂蛋白、糖类、脂类及核酸等），浓缩富集了有保护或辅助治疗作用的抗原成分，避免或降低了疫苗接种后的副反应发生率，使得纯化病毒疫苗比传统粗制疫苗更加安全[8-9]。
离子交换色谱具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入并迅速扩散，多孔，吸附容量大，同时具有亲水性，对大分子吸附不牢固，用温和的条件可以洗脱，不会引起蛋白质变性，该技术已经被广泛应用于蛋白质、酶、核酸和多糖的分离纯化并获得了较理想的结果，是一种高效的蛋白质纯化方法[10]。在应用时需要考虑多方面的因素，如离子交换剂和缓冲液的性质、离子强度、pH等。同种电荷的不同离子交换剂侧链基团具有不同的pKa，固定条件下对蛋白质有不同大小的结合能力，因此有强弱之分，强离子交换剂能有效结合蛋白质，减少蛋白质的损失，但洗脱时需要较高的盐浓度，或大幅度改变pH[11]。笔者采用阴离子交换层析方法对FMDV进行纯化，确定了较理想的上样量、上样流速、平衡和过柱缓冲液的pH和盐浓度等影响层析纯化效果的参数，为口蹄疫病毒灭活疫苗纯化工艺的建立提供了参考。
参考文献
[1] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997.
[2] 陈来同，唐运.生物化学产品制备技术[M].北京：科学技术文献出版社，2003.
[3] 王雪，宋长征.离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化[J].中国生物工程杂志，2004，24（1）：77-80.
[4] COOPERMAN L，MICHAELI D.The immunogenicity of injectable collagen.I.A 1year prospective study[J].J Am Acad Dermatol，1984，10（4）：638-646.
[5] 姜维，黄强，扶雄.离子交换层析法分离纯化低聚糖研究[J].粮食与油脂，2011（11）：48-50.
[6] 朱家文，武斌，陈葵，等.离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白[J].华东理工大学学报，2002，28（4）：341-345.
[7] JIANG B，WANG Y，SALUZZO J F，et al.Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice [J].Hum Vaccin，2008，4（2）：143-147.
[8] KUNDU A，CRAMAER S M.Lowmolecularweight displacers for highresolution protein separations[J].Anal Biochem，1997，248（1）：111-116.
[9] PEIXOTO C，SOUSA M F，SILVA A C，et al.Downstream processing of triple layered rotavirus like particles[J].J Biotechnol，2007，127（3）：452-461.
[10] WOZNEY J M.Overview of bone morphogenetic proteins[J].Spine，2002，27（16S）：2-8.
[11] 朱厚础.蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].北京：科学出版社，1999：40-41.