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摘要：从科研成果中选取一个成熟的适于学生操作的实验，经过多种条件优化后，设计出一个崭新的验证细胞骨架形态和支持作用的高级实验。该实验选用细胞免疫化学的方法通过抗原抗体的特异性反应对经过药物处理的CHO细胞中间纤维进行化学染色，间接反应细胞骨架的三种成分对维持细胞形态的重要作用。通过教学实践，学生对基础知识和高级实验技能的掌握均有提高。
关键词：实验设计；教学实践；细胞骨架
细胞生物学迅猛发展，新的研究成果层出不穷。细胞生物学理论教材的内容也不断增加新的知识，使学生更加全面透彻地了解细胞结构和功能。细胞生物学实验课程则帮助学生巩固理论知识、掌握细胞生物学研究的基本实验技能，引导学生树立正确的科学观和严谨的科学作风，培养学生独立进行细胞生物学科研实验的能力以及创新能力。
目前，细胞生物学实验课内容却相对陈旧，多是围绕基本实验技术开展。随着科研水平的不断提高，要求学生不仅要掌握基本的实验手段，还要学会运用先进的实验技术验证已有的内容，甚至自行设计实验，解决未知的问题。这样训练学生才能顺应时代的要求，满足科技发展的需要，为国家培养输送专业基础扎实，实验技术一流，具有积极性、主动性和创造性的高素质科研人才。为此，我们必须按照生命科学学科发展和人才培养的要求，加强实验教学条件建设，及时改进实验，增设综合性、创新性实验，不断拓展时空，引导学生全面成才。
上海交通大学生命科学技术学院进行了新实验的尝试。以往选用的实验如“考马斯亮蓝染色显示细胞骨架实验”采用非特异方法显示洋葱细胞内的微丝束。该实验目的是帮助学生加深对细胞骨架的认识，并了解染色方法和步骤。但是这种染色方法特异性极差，只要是蛋白质都能被显出颜色。与当前科研实验室对细胞骨架的免疫荧光特异性染色相比，该方法极其落后，不仅无法应用到将来的科研中，还影响染色结果，难以分辨清楚细胞中的微丝结构。在经费、仪器设备和学时允许的条件下，我们以当前较先进的实验技术设计了新的验证性实验进行替代，即CHO(中华仓鼠卵巢)细胞中间纤维的免疫酶标染色实验。该实验以体外培养的动物细胞为研究对象，通过免疫化学染色方法，特异性显示经处理后的CHO细胞内的细胞骨架成分之一——中间纤维的分布。为了使这个崭新的实验能够顺利应用于教学，我们不断改进预实验方法，做充分准备，保证每位学生有一份细胞样品，并亲自动手做完整个实验流程，取得预期结果。经过两个学期的实践，该实验已经成功取代了旧实验，极大地激发了学生的学习热情，增强了学生求知的欲望和对科学的热爱，培养了学生主动探究和思考的能力。
一、实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构，由微丝(microfdament)、微管(microtubule)和中间纤维(intermediate filament)构成。在维持细胞形态，承受细胞外力，保持细胞内部结构有序性方面起重要作用，并且参与许多重要的生命活动。细胞松弛素B是从真菌中分离的一类特异性抑制肌动蛋白聚合的药物，可以破坏微丝结构。秋水仙素是一种生物碱，能够与微管特异性结合，改变微管组装和去组装稳定状态的平衡，破坏微管的动态性质。培养的动物细胞经细胞松弛素B和秋水仙素处理后，细胞皮层的微丝网络结构和由中心体发出的微管网络结构都遭到破坏，细胞强度明显降低。在离心力的作用下，密度较大的细胞核连同周边的一些中间纤维会偏离原来的位置，突出到一侧。
免疫酶标染色技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应进行抗原抗体的定性或定量分析，亦可用于细胞或组织中抗原抗体的定位研究。中华仓鼠卵巢细胞(CHO)的中间纤维成分——波形纤维蛋白的分布与微管系统基本一致，从细胞核向细胞膜放射状分布。用抗微管和微丝聚合的药物处理CHO细胞再经离心作用，波形纤维蛋白的分布随着细胞的脱核作用也发生明显的变化。通过抗波形纤维蛋白的特异性抗体进行间接免疫酶标染色，即可清晰明了、生动形象的观察到CHO细胞的脱核现象及其中间纤维分布的变化，从而帮助学生加强理解细胞骨架支持作用的概念。
二、实验材料和仪器
(1)CHO细胞。
(2)细胞培养试剂：DMEM高糖培养基、小牛血清、胰酶－EDTA消化液。
(3)细胞培养和染色器具：细胞培养瓶、培养皿、细胞爬片、1mlEp管、10ml染色缸、湿盒。
(4)细胞处理和染色试剂：细胞松弛素B、秋水仙素、甲醇。丙酮(1：1，分析纯)固定液、抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体、碱性磷酸酶(Ap)标记的抗小鼠二抗、NBT／BCIP底物显色液、PBS-0.2％TritonXl00。
(5)实验用仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、恒温孵育箱、Motie显微数码互动系统。
三、实验方法
(1)CHO细胞培养扩增。复苏CHO细胞，在含有10％小牛血清的DMEM高糖培养液(完全培养基)，37度，5％C02培养箱中常规培养。用0.25％胰酶-0.53ramEDTA消化液处理细胞，完全培养基终止消化，离心，分瓶传代培养。用干净的载玻片制成长约21ram宽约7mm的小玻片，一端裁成圆钝形以防扎破Ep管，另一端做好正反标记。将这种自制的细胞爬片高压灭菌，临用前放置在无菌细胞培养皿中。
(2)药物处理。根据学生人数按需要扩增到一定数量的CHO细胞后，将细胞消化，离心，完全培养液重悬，计数，以lxl06个tmL密度均匀种植在底面铺有爬片的培养皿中，37度静止培养1-3天。将细胞分为实验组和对照组，实验组先加入1mg／mL(生理盐水配制)的秋水仙素溶液，使终浓度为10gg／mL。37"C孵育3，5h。再加入lmg／mL(DMSO配制)的细胞松弛素B溶液，使终浓度为10ug／rnL，37度孵育30rain。对照组细胞相应用等量生理盐水和DMSO处理。
(3)离心。将药物处理后的细胞爬片用镊子小心取出，分发给学生，每位学生一张实验组和一张对照组爬片。学生将实验组爬片圆端向下放入含有药物培养基的lmL Ep管中，对照组细胞爬片放入仅含完全培养基的Ep管中。8000rpm离心15min。
(4)固定。将两张爬片分别从Ep管中取出，按顺序立刻放入含有20"C预冷的甲醇一丙酮(1：1)固定液的小染色缸内，固定10rain。PBS洗3次，每次5min。
(5)免疫酶标染色。将一张干燥的载玻片放入湿盒，分别将实验组和对照组爬片放在其上，令细胞面向上。用PBS-0，2％TritonXl00以1：50浓度稀释抗Vimentin单抗，分装并分发给每组学生。学生将抗体稀释液滴加至
关键词：实验设计；教学实践；细胞骨架
细胞生物学迅猛发展，新的研究成果层出不穷。细胞生物学理论教材的内容也不断增加新的知识，使学生更加全面透彻地了解细胞结构和功能。细胞生物学实验课程则帮助学生巩固理论知识、掌握细胞生物学研究的基本实验技能，引导学生树立正确的科学观和严谨的科学作风，培养学生独立进行细胞生物学科研实验的能力以及创新能力。
目前，细胞生物学实验课内容却相对陈旧，多是围绕基本实验技术开展。随着科研水平的不断提高，要求学生不仅要掌握基本的实验手段，还要学会运用先进的实验技术验证已有的内容，甚至自行设计实验，解决未知的问题。这样训练学生才能顺应时代的要求，满足科技发展的需要，为国家培养输送专业基础扎实，实验技术一流，具有积极性、主动性和创造性的高素质科研人才。为此，我们必须按照生命科学学科发展和人才培养的要求，加强实验教学条件建设，及时改进实验，增设综合性、创新性实验，不断拓展时空，引导学生全面成才。
上海交通大学生命科学技术学院进行了新实验的尝试。以往选用的实验如“考马斯亮蓝染色显示细胞骨架实验”采用非特异方法显示洋葱细胞内的微丝束。该实验目的是帮助学生加深对细胞骨架的认识，并了解染色方法和步骤。但是这种染色方法特异性极差，只要是蛋白质都能被显出颜色。与当前科研实验室对细胞骨架的免疫荧光特异性染色相比，该方法极其落后，不仅无法应用到将来的科研中，还影响染色结果，难以分辨清楚细胞中的微丝结构。在经费、仪器设备和学时允许的条件下，我们以当前较先进的实验技术设计了新的验证性实验进行替代，即CHO(中华仓鼠卵巢)细胞中间纤维的免疫酶标染色实验。该实验以体外培养的动物细胞为研究对象，通过免疫化学染色方法，特异性显示经处理后的CHO细胞内的细胞骨架成分之一——中间纤维的分布。为了使这个崭新的实验能够顺利应用于教学，我们不断改进预实验方法，做充分准备，保证每位学生有一份细胞样品，并亲自动手做完整个实验流程，取得预期结果。经过两个学期的实践，该实验已经成功取代了旧实验，极大地激发了学生的学习热情，增强了学生求知的欲望和对科学的热爱，培养了学生主动探究和思考的能力。
一、实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构，由微丝(microfdament)、微管(microtubule)和中间纤维(intermediate filament)构成。在维持细胞形态，承受细胞外力，保持细胞内部结构有序性方面起重要作用，并且参与许多重要的生命活动。细胞松弛素B是从真菌中分离的一类特异性抑制肌动蛋白聚合的药物，可以破坏微丝结构。秋水仙素是一种生物碱，能够与微管特异性结合，改变微管组装和去组装稳定状态的平衡，破坏微管的动态性质。培养的动物细胞经细胞松弛素B和秋水仙素处理后，细胞皮层的微丝网络结构和由中心体发出的微管网络结构都遭到破坏，细胞强度明显降低。在离心力的作用下，密度较大的细胞核连同周边的一些中间纤维会偏离原来的位置，突出到一侧。
免疫酶标染色技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应进行抗原抗体的定性或定量分析，亦可用于细胞或组织中抗原抗体的定位研究。中华仓鼠卵巢细胞(CHO)的中间纤维成分——波形纤维蛋白的分布与微管系统基本一致，从细胞核向细胞膜放射状分布。用抗微管和微丝聚合的药物处理CHO细胞再经离心作用，波形纤维蛋白的分布随着细胞的脱核作用也发生明显的变化。通过抗波形纤维蛋白的特异性抗体进行间接免疫酶标染色，即可清晰明了、生动形象的观察到CHO细胞的脱核现象及其中间纤维分布的变化，从而帮助学生加强理解细胞骨架支持作用的概念。
二、实验材料和仪器
(1)CHO细胞。
(2)细胞培养试剂：DMEM高糖培养基、小牛血清、胰酶－EDTA消化液。
(3)细胞培养和染色器具：细胞培养瓶、培养皿、细胞爬片、1mlEp管、10ml染色缸、湿盒。
(4)细胞处理和染色试剂：细胞松弛素B、秋水仙素、甲醇。丙酮(1：1，分析纯)固定液、抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体、碱性磷酸酶(Ap)标记的抗小鼠二抗、NBT／BCIP底物显色液、PBS-0.2％TritonXl00。
(5)实验用仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、恒温孵育箱、Motie显微数码互动系统。
三、实验方法
(1)CHO细胞培养扩增。复苏CHO细胞，在含有10％小牛血清的DMEM高糖培养液(完全培养基)，37度，5％C02培养箱中常规培养。用0.25％胰酶-0.53ramEDTA消化液处理细胞，完全培养基终止消化，离心，分瓶传代培养。用干净的载玻片制成长约21ram宽约7mm的小玻片，一端裁成圆钝形以防扎破Ep管，另一端做好正反标记。将这种自制的细胞爬片高压灭菌，临用前放置在无菌细胞培养皿中。
(2)药物处理。根据学生人数按需要扩增到一定数量的CHO细胞后，将细胞消化，离心，完全培养液重悬，计数，以lxl06个tmL密度均匀种植在底面铺有爬片的培养皿中，37度静止培养1-3天。将细胞分为实验组和对照组，实验组先加入1mg／mL(生理盐水配制)的秋水仙素溶液，使终浓度为10gg／mL。37"C孵育3，5h。再加入lmg／mL(DMSO配制)的细胞松弛素B溶液，使终浓度为10ug／rnL，37度孵育30rain。对照组细胞相应用等量生理盐水和DMSO处理。
(3)离心。将药物处理后的细胞爬片用镊子小心取出，分发给学生，每位学生一张实验组和一张对照组爬片。学生将实验组爬片圆端向下放入含有药物培养基的lmL Ep管中，对照组细胞爬片放入仅含完全培养基的Ep管中。8000rpm离心15min。
(4)固定。将两张爬片分别从Ep管中取出，按顺序立刻放入含有20"C预冷的甲醇一丙酮(1：1)固定液的小染色缸内，固定10rain。PBS洗3次，每次5min。
(5)免疫酶标染色。将一张干燥的载玻片放入湿盒，分别将实验组和对照组爬片放在其上，令细胞面向上。用PBS-0，2％TritonXl00以1：50浓度稀释抗Vimentin单抗，分装并分发给每组学生。学生将抗体稀释液滴加至