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摘要 哈茨木霉菌是一种重要的生防菌，灰葡萄孢菌是番茄灰霉病的病原菌，通过对峙试验研究哈芡木霉菌对灰葡萄孢菌的抑制作用。结果表明，该哈茨木霉菌在室内能够很好地抑制灰葡萄孢菌的生长。哈茨木霉菌的培养采用固液双相培养的方法，用正交试验优化法分别对液体培养基和固体培养基进行优化。结果表明，该哈茨木霉菌在优化好的固液双相培养基上能产生5.6×109个孢子。
关键词 哈茨木霉菌；灰葡萄孢菌；抑制作用；培养基优化
中图分类号 Q93-335 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0098-01
Abstract Trichoderma harzianum is a kind of important biocontrol fungus.Botrytis cinerea Pers is the pathogen of tomato grey mould.The results of dual culture showed that the T.harzianum could restrain the growth of Botrytis cinerea Pers.Cultivation of T.harzianum adopted the solid-liquid two-phase method，used orthogonal test of the liquid medium and solid medium to optimize.The results showed that the T.harzianum could produce 5.6×109 spores in the mediums.
Key words Trichoderma harzianum；Botrytis cinerea Pers；inhibitory action；medium optimization
番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能够侵染番茄叶片、茎和青果等植株地上部分，发病严重时会造成大量烂花、烂果，直接影响产量。木霉菌作为一类重要的生防真菌，广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中，具有适应性强、存在范围广和广谱、高效等优点[1]。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中应用最早、最广的一个菌种，可以用于预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害[2-3]。
哈茨木霉孢子耐受性强，易于加工成制剂，是一类重要的生防真菌，其真菌孢子培养主要采用固体发酵。固体发酵虽然操作简单，但易受杂菌污染，产生孢子低，发酵时间长，经济效率低。目前，主要采用先用液体发酵产生菌丝，再将菌液接种到固体培养基上培养产生孢子的固液双相发酵培养模式。正交试验优化法是优化培养基常用的方法。因此，采用正交试验优化法对哈茨木霉的培养进行初步优化，为其在生防中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
供试菌种为哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物农药工程研究中心分离获得；试验仪器有恒温培养箱、恒温摇床、冰箱；试剂有葡萄糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培养基为PDA培养基、营养肉汤培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板对峙培养是研究生防菌效价最常用的方法之一，该方法操作简单，能直接观察抑制效果，因而本试验采用平板对峙培养测定哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制效果[4]。具体操作如下：在PDA培养基中心位置接种直径为6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌饼，距离平板中心两侧2 cm处，分别接种一块直径为6 mm的哈茨木霉菌菌饼，以只接种番茄灰葡萄孢菌菌饼为对照，28 ℃恒温培养6～9 d后，与对照对比，观察记载哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制情况，每组处理3次重复。
1.2.2 哈茨木霉菌培养基优化。
（1）液体培养基优化。取制好的哈茨木霉菌孢子种子液（浓度为108 cfu/mL），按1%接种量分别接种于不同处理的液体培养基中，采用4因素3水平正交试验对培养基进行优化，正交试验的因素与水平设计见表1。培养条件为25 ℃，摇床200 r/min振荡培养7 d，7 d后过滤菌丝，80 ℃烘干并称量菌丝干重[5-6]。每个处理3次重复。
（2）固体培养基优化。取培养7 d的哈茨木霉菌菌丝悬浮液种子液（菌丝干重约为0.002 g/mL）按20%接种量分别接种于不同处理的固体蛭石培养基中，采用4因素3水平正交试验对培养基进行优化，正交试验的因素与水平设计见表2。培养条件为25 ℃，培养5 d，5 d后采用血球计数板法计算孢子数目。
2 结果与分析
2.1 哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用
由图1可知，茨木霉菌在室内对番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培养基上长势迅速，第3天哈茨木霉菌就表现出对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。对（下转第102页）
峙试验第5天时，可以明显看出哈茨木霉菌继续生长，占据整个培养皿，番茄灰葡萄孢菌菌丝出现浓缩、消解等现象。在显微镜观察下，哈茨木霉菌菌丝入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌丝出现断裂。随着培养时间的延长，最终番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。
2.2 哈茨木霉菌的培养基优化
2.2.1 液体培养基优化。将哈茨木霉菌孢子接种到表1中配方水平的培养基，培养7 d后，称量菌丝干重，结果见表3。可以看出，该哈茨木霉菌液体培养基最优组合为葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生饼粉4%。 2.2.2 固体培养基优化。将哈茨木霉菌菌丝接种到表2的固体培养基，培养7 d后，通过血球计数板计数，结果见表4。可以看出，该哈茨木霉菌液体培养基最优组合为葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生饼粉4%、麦麸6%。
3 结论与讨论
哈茨木霉菌是一种重要的生防菌，能够抑制多种植物病原菌生长。平板对峙试验表明，哈茨木霉菌能够很好地抑制番茄灰霉病菌生长[7]。以往研究多侧重于哈茨木霉菌菌丝的生长，但菌丝不易于保存及应用，加工成制剂困难。国外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多数是孢子制剂。本试验哈茨木霉菌在优化的固液双向培养基上能产生5.6×109个孢子，方便加工成制剂及运输。
本试验仅限于室内平板培养，对于该哈茨木霉菌在大田生产上是否具有良好的防效有待于进一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性强、耐储存、方便運输等特点，液体发酵生产出较多菌丝，固体发酵易受杂菌的污染，产生孢子低，发酵时间长，因而采用固液双相发酵的方法是一种不错的选择。正交优化初步对哈茨木霉菌培养基进行优化，哈茨木霉菌产生孢子受光照、温度等很多条件的影响，下一步需要通过正交优化或者响应面法进一步深度优化[8]。
4 参考文献
[1] 唐琳，赵辉.哈茨木霉菌T6对茄子幼苗根部防御酶系的研究[J].广东农业科学，2011（14）：79-81.
[2] 陈方新，齐永霞.哈茨木霉对几种植物病原真菌的拮抗作用及其抗药性测定[J].中国农学通报，2005（11）：314-317.
[3] 傅俊范，魏晓兵，周如军，等.哈茨木霉菌Tri41对人参锈腐病菌的抑制作用[J].吉林农业大学学报，2015（1）：52-56.
[4] 李梅云，谭丽华，方敦煌，等.哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究[J].微生物学通报，2006（6）：79-83.
[5] 李栎，何月秋，苏春丽.不同条件对哈茨木霉菌株Th-B菌丝生长的影响[J].云南农业大学学报，2004（6）：677-680.
[6] 张爱华，白石，周国兴，等.哈茨木霉发酵条件的初步研究[J].安徽农业科学，2008（3）：9821-9822.
[7] 岳宪化，胡夫防，段丽峰，等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病试验[J].中国果树，2014（2）：54-56.
[8] 王慧中，赵培洁，陈卫辉，等.哈茨木霉浅层液体培养适宜条件的研究[J].浙江农业学报，1995（1）：61-62.
关键词 哈茨木霉菌；灰葡萄孢菌；抑制作用；培养基优化
中图分类号 Q93-335 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0098-01
Abstract Trichoderma harzianum is a kind of important biocontrol fungus.Botrytis cinerea Pers is the pathogen of tomato grey mould.The results of dual culture showed that the T.harzianum could restrain the growth of Botrytis cinerea Pers.Cultivation of T.harzianum adopted the solid-liquid two-phase method，used orthogonal test of the liquid medium and solid medium to optimize.The results showed that the T.harzianum could produce 5.6×109 spores in the mediums.
Key words Trichoderma harzianum；Botrytis cinerea Pers；inhibitory action；medium optimization
番茄灰霉病是危害番茄的主要病害之一，該致病菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers），能够侵染番茄叶片、茎和青果等植株地上部分，发病严重时会造成大量烂花、烂果，直接影响产量。木霉菌作为一类重要的生防真菌，广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中，具有适应性强、存在范围广和广谱、高效等优点[1]。哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）是木霉菌中应用最早、最广的一个菌种，可以用于预防由腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌引起的植物病害[2-3]。
哈茨木霉孢子耐受性强，易于加工成制剂，是一类重要的生防真菌，其真菌孢子培养主要采用固体发酵。固体发酵虽然操作简单，但易受杂菌污染，产生孢子低，发酵时间长，经济效率低。目前，主要采用先用液体发酵产生菌丝，再将菌液接种到固体培养基上培养产生孢子的固液双相发酵培养模式。正交试验优化法是优化培养基常用的方法。因此，采用正交试验优化法对哈茨木霉的培养进行初步优化，为其在生防中的应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
供试菌种为哈茨木霉菌、番茄灰葡萄孢菌，由河南省生物农药工程研究中心分离获得；试验仪器有恒温培养箱、恒温摇床、冰箱；试剂有葡萄糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、NaOH、HCl；培养基为PDA培养基、营养肉汤培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。平板对峙培养是研究生防菌效价最常用的方法之一，该方法操作简单，能直接观察抑制效果，因而本试验采用平板对峙培养测定哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制效果[4]。具体操作如下：在PDA培养基中心位置接种直径为6 mm的番茄灰葡萄孢菌菌饼，距离平板中心两侧2 cm处，分别接种一块直径为6 mm的哈茨木霉菌菌饼，以只接种番茄灰葡萄孢菌菌饼为对照，28 ℃恒温培养6～9 d后，与对照对比，观察记载哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制情况，每组处理3次重复。
1.2.2 哈茨木霉菌培养基优化。
（1）液体培养基优化。取制好的哈茨木霉菌孢子种子液（浓度为108 cfu/mL），按1%接种量分别接种于不同处理的液体培养基中，采用4因素3水平正交试验对培养基进行优化，正交试验的因素与水平设计见表1。培养条件为25 ℃，摇床200 r/min振荡培养7 d，7 d后过滤菌丝，80 ℃烘干并称量菌丝干重[5-6]。每个处理3次重复。
（2）固体培养基优化。取培养7 d的哈茨木霉菌菌丝悬浮液种子液（菌丝干重约为0.002 g/mL）按20%接种量分别接种于不同处理的固体蛭石培养基中，采用4因素3水平正交试验对培养基进行优化，正交试验的因素与水平设计见表2。培养条件为25 ℃，培养5 d，5 d后采用血球计数板法计算孢子数目。
2 结果与分析
2.1 哈茨木霉菌对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用
由图1可知，茨木霉菌在室内对番茄灰葡萄孢菌有很好的抑制效果。哈茨木霉菌在PDA培养基上长势迅速，第3天哈茨木霉菌就表现出对番茄灰葡萄孢菌的抑制作用。对（下转第102页）
峙试验第5天时，可以明显看出哈茨木霉菌继续生长，占据整个培养皿，番茄灰葡萄孢菌菌丝出现浓缩、消解等现象。在显微镜观察下，哈茨木霉菌菌丝入侵番茄灰葡萄孢菌菌落，番茄灰霉菌丝出现断裂。随着培养时间的延长，最终番茄灰霉病菌完全被抑制，直至死亡消失。
2.2 哈茨木霉菌的培养基优化
2.2.1 液体培养基优化。将哈茨木霉菌孢子接种到表1中配方水平的培养基，培养7 d后，称量菌丝干重，结果见表3。可以看出，该哈茨木霉菌液体培养基最优组合为葡萄糖1.5%、（NH4）2SO4 0.25%、酵母粉4%、花生饼粉4%。 2.2.2 固体培养基优化。将哈茨木霉菌菌丝接种到表2的固体培养基，培养7 d后，通过血球计数板计数，结果见表4。可以看出，该哈茨木霉菌液体培养基最优组合为葡萄糖1.5%、酵母粉2%、花生饼粉4%、麦麸6%。
3 结论与讨论
哈茨木霉菌是一种重要的生防菌，能够抑制多种植物病原菌生长。平板对峙试验表明，哈茨木霉菌能够很好地抑制番茄灰霉病菌生长[7]。以往研究多侧重于哈茨木霉菌菌丝的生长，但菌丝不易于保存及应用，加工成制剂困难。国外已有商品化的哈茨木霉菌成品，多数是孢子制剂。本试验哈茨木霉菌在优化的固液双向培养基上能产生5.6×109个孢子，方便加工成制剂及运输。
本试验仅限于室内平板培养，对于该哈茨木霉菌在大田生产上是否具有良好的防效有待于进一步研究。哈茨木霉菌的孢子具有抗性强、耐储存、方便運输等特点，液体发酵生产出较多菌丝，固体发酵易受杂菌的污染，产生孢子低，发酵时间长，因而采用固液双相发酵的方法是一种不错的选择。正交优化初步对哈茨木霉菌培养基进行优化，哈茨木霉菌产生孢子受光照、温度等很多条件的影响，下一步需要通过正交优化或者响应面法进一步深度优化[8]。
4 参考文献
[1] 唐琳，赵辉.哈茨木霉菌T6对茄子幼苗根部防御酶系的研究[J].广东农业科学，2011（14）：79-81.
[2] 陈方新，齐永霞.哈茨木霉对几种植物病原真菌的拮抗作用及其抗药性测定[J].中国农学通报，2005（11）：314-317.
[3] 傅俊范，魏晓兵，周如军，等.哈茨木霉菌Tri41对人参锈腐病菌的抑制作用[J].吉林农业大学学报，2015（1）：52-56.
[4] 李梅云，谭丽华，方敦煌，等.哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究[J].微生物学通报，2006（6）：79-83.
[5] 李栎，何月秋，苏春丽.不同条件对哈茨木霉菌株Th-B菌丝生长的影响[J].云南农业大学学报，2004（6）：677-680.
[6] 张爱华，白石，周国兴，等.哈茨木霉发酵条件的初步研究[J].安徽农业科学，2008（3）：9821-9822.
[7] 岳宪化，胡夫防，段丽峰，等.哈茨木霉菌防治葡萄霜霉病试验[J].中国果树，2014（2）：54-56.
[8] 王慧中，赵培洁，陈卫辉，等.哈茨木霉浅层液体培养适宜条件的研究[J].浙江农业学报，1995（1）：61-62.