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论文摘要： 文章分析了六味地黄丸（浓缩丸）中测定丹皮酚、马钱苷含量的高效液相色谱方法。
主题词： 六味地黄丸 成份测定
中图分类号：TQ421.1
六味地黄丸（浓缩丸）质量标准收载于部颁标准第11册。该方出于宋代·钱乙《小儿药证直诀·卷下》，系中医补肾的经典方，为滋阴补肾之著名方剂。笔者 参考 《 中国 药典》对该产品进行研究，在原部颁标准的基础上，对质量标准进行整理提高，用HPLC法测定牡丹皮中丹皮酚及山茱萸中马钱苷的含量，并进行了方法学考察。现将结果报道如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器Waters液相色谱仪，Waters2487双波长紫外检测器，515泵（美国），7715 i进样器（美国），Empower色谱工作站（美国），C18色谱柱（依利特：250 mm×4.6 mm，5 μm）。
1.2 试剂甲醇、乙腈为色谱纯（中国上海陆都试剂厂），乙醚、乙醇、磷酸、四氢呋喃等均为分析醇，水为高纯水。
1.3 对照品丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，110708-9704），马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，111640-200401）
1.4 样品六味地黄丸（浓缩丸）为苏州长甲药业有限公司生产。
2 方法与结果
2.1 牡丹皮的含量测定
2.1.1 色谱条件C18柱（依利特；250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（6：4），流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长为274 nm。
2.1.2 供试品溶液的制备取本品适量，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 对照品溶液的制备精密称取对照品适量，加甲醇制成每毫升含16 μg的溶液，作为对照品溶液。
2.1.4 空白对照实验按处方去牡丹皮制成空白制剂，取空白对照样品0.44 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，与供试品制备相同方法制得缺牡丹皮空白溶液。分别取出对照品溶液、样品供试液、空白对照溶液依法进样检验。结果显示空白对照无干扰。
2.1.5 线性关系的考察精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇稀释至54.1 μg/ml，摇匀。分别精密吸取丹皮酚对照品溶液1，2，3，4，5 ml，加甲醇稀释至10 ml，摇匀，分别得浓度为5.41，10.82，16.23，21.64，27.05 μg/ml的丹皮酚溶液。照高效液相色谱法，进样10 μl，测定其峰面积。以峰面积为纵坐标，以进样量（ng）为横坐标，进行回归处理，结果显示：丹皮酚溶液在54.1～270.5 ng的范围内线性关系良好。其回归方程为Y=9 636.508X-545.6。相关系数r=0.999 6。
2.1.6 精密度实验精密称取供试品（批号0501102）0.5 g，按2.1.2方法制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，测定峰面积。RSD=0.99%（n=6），表明精密度良好。
2.1.7 稳定性实验取精密度供试液，分别在0，2，4，6，8，12 h进样，测定峰面积，RSD=1.07%，结果表明丹皮酚溶液在12 h内稳定。
2.1.8 重复性实验精密称取供试品（批号0501102）6份，分别按供试液制备项下的方法制备供试品溶液，依法进行含量测定。RSD=1.32%。
2.1.9 加样回收率实验精密称取已知含量的供试品0.25 g各6份，分别加入一定量的丹皮酚对照品溶液，按供试品制备项下的方法制备。依法测定， 计算 回收率。
2.2 山茱萸的含量测定
2.2.1 色谱条件C18柱（依利特；250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（15：85），流速1.0 ml·min-1，柱温25℃，检测波长为236 nm。
2.2.2 供试品溶液的制备[1]取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇100 ml，称定重量，超声处理10 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，再称定重量，用50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40 ml过5 cm柱高中性氧化铝柱（内径1 cm），再以50%甲醇50 ml洗脱，合并流出液和洗脱液，蒸干，残渣加50%甲醇溶解，并转移至10 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.2.3 对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，即得。
2.2.4 线性关系考察精密吸取0.233 mg/ml的马钱苷对照品溶液1，2，4，8，16，20 μl分别注入高效液相色谱仪测定峰面积，以马钱苷的进样量为横坐标，峰面积的积分值为纵坐标进行回归，r=0.9996。结果表明，马钱苷在0.223～4.46 μg范围内呈良好的线性关系。
2.2.5 空白对照实验按处方去山茱萸制成空白制剂，取空白对照样品0.42 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，与供试品制备相同方法制得缺山茱萸空白溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20 μl，注入色谱仪，结果表明空白对照无干扰。
2.2.6 精密度实验取稳定性试验项下的供试液，连续重复进样6次，测定峰面积，RSD=1.28%。
2.2.7 稳定性实验取本品（批号0501221）约0.5 g，精密称定，照供试品制备项下的方法制备成供试液。分别于配制后0，1，
2，4，8 h依法测定，马钱苷峰面积RSD=1.21%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。
2.2.8 重复性实验取本品（批号：0501221）平行称取6份，按供试品制备方法制得6份供试品溶液进行测定，分别依次进行测定，RSD=1.20%。
2.2.9 加样回收率实验精密称取已知含量的供试品约0.5 g（浓度0.1120% ；批号0501221）6份，再分别精密加入0.05 mg/ml马钱苷对照品溶液9，6，4 ml，置具塞锥形瓶中，分别按供试品制备方法项下制备供试液，并依法测定。
2.3 样品含量测定取本品5批，依法进行马钱苷和丹皮酚的含量测定，同时按原部颁标准用紫外分光光度法测定样品中丹皮酚的含量。
3 讨论
比较了丹皮酚的样品处理方法，以水蒸气蒸馏，甲醇超声、回流，乙醇超声、回流，以甲醇超声操作简便，提取率高且杂质干扰少。对超声时间（功率250 W，频率40 kHz）进行考察，超声30 min后，样品含量即无明显变化。用本方法测定的样品含量略高于原部颁标准中的紫外分分光度法。
本实验比较了马钱含量测定流动相乙腈-水、四氢呋喃-乙腈-甲醇0.05%磷酸溶液，前者理论板数、分离度、对称度均较好，而后者峰形对称度稍差，因此选择前者。
主题词： 六味地黄丸 成份测定
中图分类号：TQ421.1
六味地黄丸（浓缩丸）质量标准收载于部颁标准第11册。该方出于宋代·钱乙《小儿药证直诀·卷下》，系中医补肾的经典方，为滋阴补肾之著名方剂。笔者 参考 《 中国 药典》对该产品进行研究，在原部颁标准的基础上，对质量标准进行整理提高，用HPLC法测定牡丹皮中丹皮酚及山茱萸中马钱苷的含量，并进行了方法学考察。现将结果报道如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器Waters液相色谱仪，Waters2487双波长紫外检测器，515泵（美国），7715 i进样器（美国），Empower色谱工作站（美国），C18色谱柱（依利特：250 mm×4.6 mm，5 μm）。
1.2 试剂甲醇、乙腈为色谱纯（中国上海陆都试剂厂），乙醚、乙醇、磷酸、四氢呋喃等均为分析醇，水为高纯水。
1.3 对照品丹皮酚对照品（中国药品生物制品检定所，110708-9704），马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，111640-200401）
1.4 样品六味地黄丸（浓缩丸）为苏州长甲药业有限公司生产。
2 方法与结果
2.1 牡丹皮的含量测定
2.1.1 色谱条件C18柱（依利特；250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（6：4），流速1.0 ml·min-1，柱温30℃，检测波长为274 nm。
2.1.2 供试品溶液的制备取本品适量，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 对照品溶液的制备精密称取对照品适量，加甲醇制成每毫升含16 μg的溶液，作为对照品溶液。
2.1.4 空白对照实验按处方去牡丹皮制成空白制剂，取空白对照样品0.44 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，与供试品制备相同方法制得缺牡丹皮空白溶液。分别取出对照品溶液、样品供试液、空白对照溶液依法进样检验。结果显示空白对照无干扰。
2.1.5 线性关系的考察精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇稀释至54.1 μg/ml，摇匀。分别精密吸取丹皮酚对照品溶液1，2，3，4，5 ml，加甲醇稀释至10 ml，摇匀，分别得浓度为5.41，10.82，16.23，21.64，27.05 μg/ml的丹皮酚溶液。照高效液相色谱法，进样10 μl，测定其峰面积。以峰面积为纵坐标，以进样量（ng）为横坐标，进行回归处理，结果显示：丹皮酚溶液在54.1～270.5 ng的范围内线性关系良好。其回归方程为Y=9 636.508X-545.6。相关系数r=0.999 6。
2.1.6 精密度实验精密称取供试品（批号0501102）0.5 g，按2.1.2方法制成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，测定峰面积。RSD=0.99%（n=6），表明精密度良好。
2.1.7 稳定性实验取精密度供试液，分别在0，2，4，6，8，12 h进样，测定峰面积，RSD=1.07%，结果表明丹皮酚溶液在12 h内稳定。
2.1.8 重复性实验精密称取供试品（批号0501102）6份，分别按供试液制备项下的方法制备供试品溶液，依法进行含量测定。RSD=1.32%。
2.1.9 加样回收率实验精密称取已知含量的供试品0.25 g各6份，分别加入一定量的丹皮酚对照品溶液，按供试品制备项下的方法制备。依法测定， 计算 回收率。
2.2 山茱萸的含量测定
2.2.1 色谱条件C18柱（依利特；250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（15：85），流速1.0 ml·min-1，柱温25℃，检测波长为236 nm。
2.2.2 供试品溶液的制备[1]取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇100 ml，称定重量，超声处理10 min（功率250 W，频率40 kHz），放冷，再称定重量，用50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液40 ml过5 cm柱高中性氧化铝柱（内径1 cm），再以50%甲醇50 ml洗脱，合并流出液和洗脱液，蒸干，残渣加50%甲醇溶解，并转移至10 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
2.2.3 对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，即得。
2.2.4 线性关系考察精密吸取0.233 mg/ml的马钱苷对照品溶液1，2，4，8，16，20 μl分别注入高效液相色谱仪测定峰面积，以马钱苷的进样量为横坐标，峰面积的积分值为纵坐标进行回归，r=0.9996。结果表明，马钱苷在0.223～4.46 μg范围内呈良好的线性关系。
2.2.5 空白对照实验按处方去山茱萸制成空白制剂，取空白对照样品0.42 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，与供试品制备相同方法制得缺山茱萸空白溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各20 μl，注入色谱仪，结果表明空白对照无干扰。
2.2.6 精密度实验取稳定性试验项下的供试液，连续重复进样6次，测定峰面积，RSD=1.28%。
2.2.7 稳定性实验取本品（批号0501221）约0.5 g，精密称定，照供试品制备项下的方法制备成供试液。分别于配制后0，1，
2，4，8 h依法测定，马钱苷峰面积RSD=1.21%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。
2.2.8 重复性实验取本品（批号：0501221）平行称取6份，按供试品制备方法制得6份供试品溶液进行测定，分别依次进行测定，RSD=1.20%。
2.2.9 加样回收率实验精密称取已知含量的供试品约0.5 g（浓度0.1120% ；批号0501221）6份，再分别精密加入0.05 mg/ml马钱苷对照品溶液9，6，4 ml，置具塞锥形瓶中，分别按供试品制备方法项下制备供试液，并依法测定。
2.3 样品含量测定取本品5批，依法进行马钱苷和丹皮酚的含量测定，同时按原部颁标准用紫外分光光度法测定样品中丹皮酚的含量。
3 讨论
比较了丹皮酚的样品处理方法，以水蒸气蒸馏，甲醇超声、回流，乙醇超声、回流，以甲醇超声操作简便，提取率高且杂质干扰少。对超声时间（功率250 W，频率40 kHz）进行考察，超声30 min后，样品含量即无明显变化。用本方法测定的样品含量略高于原部颁标准中的紫外分分光度法。
本实验比较了马钱含量测定流动相乙腈-水、四氢呋喃-乙腈-甲醇0.05%磷酸溶液，前者理论板数、分离度、对称度均较好，而后者峰形对称度稍差，因此选择前者。