为进一步推广普及烟草代谢组学研究技术,规范烟草代谢组学数据的采集流程,提高烟草代谢组学数据的可比性和可用性,建立了适用于新鲜烟叶代谢组学研究的样品采集和质谱检测方法。将采集后的鲜烟叶迅速用锡箔纸包裹并在液氮中冷冻;将充分冷冻的烟叶样品在干冰包埋下转移至实验室,真空冷冻干燥;将干燥后的烟叶样品打碎成粉末,提取代谢物;采用9种主要基于GC-MS和LC-MS技术的检测方法收集代谢组数据,分别是6种靶向检测(植物色素、游离氨基酸、有机酸、生物碱及多酚和萜类化合物)和3种非靶向检测(脂类、基于GC-MS的全成分分析和基于LC-MS全成分分析)方法。采用所建方法对不同产区、不同品种及不同生长发育时期的第十叶位鲜烟叶进行分析。结果表明:①共定性定量500余种代谢物,涉及烟草主要初生、次生代谢物,其中绝对定量101种;②主成分分析表明不同生长发育期鲜烟叶的代谢组差异较大,如大多数胺类(包括游离氨基酸)代谢物随生长发育期变化其质量分数逐渐降低;同一期鲜烟叶代谢组的生态差异大于品种差异。该方法具有稳定性和可重复性高、数据量大且可靠、覆盖代谢物多等特点,可用于烟草代谢组学研究。