【摘 要】
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目的:探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF--α)炎症微环境下
【机 构】
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东南大学附属中大医院脊柱外科中心东南大学医学院 210009南京市
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目的:探讨锌指蛋白A20[也称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor-induced protein 3,TNFAIP3)]在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF--α)炎症微环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)衰老发生机制.方法:体外分离培养SD大鼠髓核细胞.实验分为三组:正常对照组(只加入正常培养基)、TNF-α干预组(加入不同浓度的TNF-α,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)和自然衰老组(在体外通过细胞不断增长传代至P20代).应用CCK-8细胞增殖实验、β半乳糖苷酶染色、Western blot (WB)、QT-PCR、immunofluorescence(IF)从基因、蛋白及细胞功能水平评估髓核细胞衰老变化.应用WB、QT-PCR和IF检测锌指蛋白A20、NF-κB(p65)、NF-kB(p-p65/phospho S536)表达情况.结果:与正常对照组相比,TNF-α干预48h、72h后髓核细胞的增殖能力明显降低;TNF-α干预组和衰老组β半乳糖染色阳性率较对照组明显增高;QT-PCR结果提示,与对照组比,TNF-α干预组p53表达增加(P<0.05),而A20表达随着TNF-α浓度增高而降低;衰老组A20表达较对照组减少,而p53扩增升高.WB检测显示:TNF-α可以诱导p53、A20、p-p65表达上调,而A20表达随着TNF-α浓度增加而降低;同时衰老组A20表达较对照组减少,而p-p65和p53表达增加(P<0.05);IF显示:与对照组对比,TNF-α处理下A20、p-p65表达增加,但是A20的表达随着TNF-α增加而降低,衰老组A20较对照组也明显降低,p-p65表达增加.结论:髓核细胞衰老程度与TNF-α干预存在剂量关系,TNF-α可以刺激髓核细胞A20表达升高,并激活NF-κB信号通路.而A20表达情况受细胞衰老程度影响,随着髓核细胞衰老A20所参与的作用效能逐渐减低.
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