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柠檬酸深层发酵过程中pH 值高低直接影响着生产菌(黑曲霉)的代谢活动以及柠檬酸的合成,同时在发酵过程中各种酶促反应也需要在适宜的pH 值下进行,因此发酵液的pH 值变化是发酵过程中一个重要的控制指标。探讨pH值对微生物生长和代谢的影响以及引起发酵过程pH 值变化的原因,并采取相应的控制措施,对提高柠檬酸深层发酵产酸率具有重要的指导意义。
1 结果与讨论
1、pH值对菌体生长和代谢产物合成的影响
微生物生长的pH 值范围很广,大多数pH 值在5~9 之间,其活动的pH 值范围也存在最高、最适、最低三基点。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面:一是影响酶的活性,当pH 值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢;二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄;三是影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解,从而影响微生物对这些物质的利用;四是pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。另外,pH值还会影响某些霉菌的形态。
根据不同微生物生长的最适pH值不同,可将微生物分為嗜酸性、嗜碱性、嗜中性微生物;同种微生物的生长最适pH值和产物积累pH值往往不一致,即使在产物积累阶段,由于pH值不同,也可能会得到不同的发酵产物。
2、发酵过程中pH值的检测
发酵过程中pH值的检测十分重要,只有通过检测pH值才能及时发现发酵pH值的变化规律,判断发酵是否处在相应的最适宜pH值范围之内,并及时做出相应的调节和控制。实际生产中,通常采用pH试纸和pH电极对pH值进行测量。采用取样测量发酵pH值,正常发酵每班间断取1~2 次,由于间断取样不能及时反映发酵过程的pH值,不利于发酵控制,而且多次取样会造成发酵液的浪费和环境的污染。目前已试制成功适合于发酵过程适时监测pH值的电极,能连续测定并记录pH值的变化,将信号放大输出并显示或者记录下来,实现在线检测。
3、发酵过程中pH值的调节及控制
(1)微生物生长增殖发育的pH值调节与控制。首先考虑和试验发酵培养基的基础配方,使它们适当配比,使发酵过程中的pH值在合适范围内变化。采用淀粉或薯干粉等原料的柠檬酸发酵过程,淀粉的糖化和柠檬酸的合成与积累是处在同一个环境中,都是由柠檬酸产生菌黑曲霉完成的。发酵的技术关键是兼顾糖化和产酸,保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸化糖化酶的最适pH值为4.0~4.6,随着pH值的下降,尤其当pH值降到2.2时,液化酶和糖化酶会大量被破坏,而柠檬酸发酵的最佳pH值是2.0以下。要解决两者矛盾,可采用下列方法:一是采用酸化平板驯化,分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株;二是通过调节风量来控制,通常在16~18h前控制风量,使pH值维持在有利于菌种生长和糖化作用的范围。
在薯干粉的柠檬酸发酵中,初始不调节pH值,为自然pH值,约为5.5。当接入菌种后,菌种生长繁殖消耗氮源和铵离子,使培养基的pH值下降,前期(12h)pH值下降较快,活力强的菌种培养12h,pH值可以降至2.3~2.5,这时会有少量的柠檬酸产生,但是由于发酵液固形物较多,原料成分繁杂,其中金属离子含量较多,缓冲作用大,再加上柠檬酸是3 个羧基的有机酸,氢离子释放是逐步的,所以有时培养48h,才能使pH值降至2.0以下。这样就有充分的时间让酸性糖化酶作用,使原料中的淀粉糖化较彻底,进而转化为大量的柠檬酸。当柠檬酸产量和残糖含量之和等于或接近起始还原糖时,才能提高通风量,迅速进入产酸期,使pH值迅速降至2.0以下,保证柠檬酸发酵的正常进行。
糖蜜原料本身有酸性的,也有碱性的,在黄血盐或其他方法处理前要根据不同的情况加以调节。为了得到较高和稳定的发酵产酸率,调酸度时还要考虑加热时间的影响。对于酸性原料,pH值应调得比碱性原料高些,因为它具有延时缓冲性,它配制的培养基在灭菌后会酸化,称为返酸,而碱性原料的性质正好相反。pH值调节一般用H2SO4或Na2CO3,参与调节范围为pH值6.0~7.2。
(2)发酵进入产酸期pH值的调节与控制。为了确保发酵的顺利进行,必须使其各个阶段经常处于最适pH值范围之内,这就需要在发酵过程中不断地调节和控制pH值的变化。正常发酵过程中,长菌期以后pH值的下降都能达到柠檬酸积累所希望的水平。如果达不到要求,还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加入酸(如H2SO4)或碱(如NaOH)来控制,现在常用的是以生理酸性物质(NH4)2SO4和生理碱性物质氨水来控制,它们不仅可以调节pH值,还可以补充氮源。
黑曲霉偏好于无机氮,当有机氮和无机氮同时存在时,它首先利用无机氮。在无机氮中,生理酸性氮比碱性氮好,这是因为生理酸性氮中铵离子被利用后,使培养基变酸,可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束,转入产酸阶段,pH值下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。因此,铵盐既可以调节代谢,也可以控制pH值。简单的有机氮比复杂的好,如尿素比氨基酸好,氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培养基上,NH4NO3是最好的氮源。黑曲霉以同样的速度消耗2种氮,所以培养基酸度不变。但糖蜜发酵培养基中还需添加少量NH4Cl。若原料中有机氮含量过于丰富,菌生长代谢加快,对缩短发酵周期有利,但是不利于柠檬酸积累,产酸率不高。这就是不能直接利用含蛋白质丰富的粗玉米粉的原因。
在柠檬酸发酵中途添加铵盐,尤其是当发酵中柠檬酸生成速度开始下降时,添加铵离子最为有利,且对菌体无影响,这种效应可能与铵离子对柠檬酸积累调节作用有关。近年来,我国采用高浓度薯干粉发酵,为缩短发酵周期,提高柠檬酸产酸速率,有时也添加0.01%~0.05%的(NH4)2SO4。
(3)发酵过程通风量对pH 值的调节作用。在薯干粉发酵中,黑曲霉还担负着糖化的任务,糖化的适宜pH 值在4.0左右,虽然工业上并不严格控制在4.0 水平,但在糖化基本完成之前,必须控制低风量使pH 值缓慢降到2.5,这个过程需16~18h。当产酸量加上还原糖量接近起始可发酵总量(其差比大于10g/h·L)时,则可以认为糖化已经完成,这时可适当加大风量使发酵进入产酸期。在产酸期内控制风量使产酸速率维持在2~3g/h·L,不得过快,以进一步利用糖化作用和防止菌体过早衰老。
(4)中和剂对发酵pH值调节的应用。为了防止pH值下降过快造成不利影响,也可以在发酵的第18~40h 加入少许CaCO3(5~10g/L)以中和酸度,但不得使pH 值超过3.0,否则会多产草酸。当用NH4+盐作为氮源时,可在培养基中加入CaCO3,用于中和NH4+被吸收后剩余的酸,但在操作中应注意控制染菌危险。
(5)发酵过程pH值的自动控制。柠檬酸深层发酵过程中,生产菌黑曲霉比生长速率和产物柠檬酸合成比生产速率分别有各自的最适宜pH值范围。因此,应分阶段控制生长最适pH值和产物最适pH值。可把检测的pH值结果输送到pH值控制器以指令加糖、加酸或加碱,实现自动控制,使发酵液的pH值控制在预定的数值。
1 结果与讨论
1、pH值对菌体生长和代谢产物合成的影响
微生物生长的pH 值范围很广,大多数pH 值在5~9 之间,其活动的pH 值范围也存在最高、最适、最低三基点。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面:一是影响酶的活性,当pH 值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢;二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄;三是影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解,从而影响微生物对这些物质的利用;四是pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。另外,pH值还会影响某些霉菌的形态。
根据不同微生物生长的最适pH值不同,可将微生物分為嗜酸性、嗜碱性、嗜中性微生物;同种微生物的生长最适pH值和产物积累pH值往往不一致,即使在产物积累阶段,由于pH值不同,也可能会得到不同的发酵产物。
2、发酵过程中pH值的检测
发酵过程中pH值的检测十分重要,只有通过检测pH值才能及时发现发酵pH值的变化规律,判断发酵是否处在相应的最适宜pH值范围之内,并及时做出相应的调节和控制。实际生产中,通常采用pH试纸和pH电极对pH值进行测量。采用取样测量发酵pH值,正常发酵每班间断取1~2 次,由于间断取样不能及时反映发酵过程的pH值,不利于发酵控制,而且多次取样会造成发酵液的浪费和环境的污染。目前已试制成功适合于发酵过程适时监测pH值的电极,能连续测定并记录pH值的变化,将信号放大输出并显示或者记录下来,实现在线检测。
3、发酵过程中pH值的调节及控制
(1)微生物生长增殖发育的pH值调节与控制。首先考虑和试验发酵培养基的基础配方,使它们适当配比,使发酵过程中的pH值在合适范围内变化。采用淀粉或薯干粉等原料的柠檬酸发酵过程,淀粉的糖化和柠檬酸的合成与积累是处在同一个环境中,都是由柠檬酸产生菌黑曲霉完成的。发酵的技术关键是兼顾糖化和产酸,保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸化糖化酶的最适pH值为4.0~4.6,随着pH值的下降,尤其当pH值降到2.2时,液化酶和糖化酶会大量被破坏,而柠檬酸发酵的最佳pH值是2.0以下。要解决两者矛盾,可采用下列方法:一是采用酸化平板驯化,分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株;二是通过调节风量来控制,通常在16~18h前控制风量,使pH值维持在有利于菌种生长和糖化作用的范围。
在薯干粉的柠檬酸发酵中,初始不调节pH值,为自然pH值,约为5.5。当接入菌种后,菌种生长繁殖消耗氮源和铵离子,使培养基的pH值下降,前期(12h)pH值下降较快,活力强的菌种培养12h,pH值可以降至2.3~2.5,这时会有少量的柠檬酸产生,但是由于发酵液固形物较多,原料成分繁杂,其中金属离子含量较多,缓冲作用大,再加上柠檬酸是3 个羧基的有机酸,氢离子释放是逐步的,所以有时培养48h,才能使pH值降至2.0以下。这样就有充分的时间让酸性糖化酶作用,使原料中的淀粉糖化较彻底,进而转化为大量的柠檬酸。当柠檬酸产量和残糖含量之和等于或接近起始还原糖时,才能提高通风量,迅速进入产酸期,使pH值迅速降至2.0以下,保证柠檬酸发酵的正常进行。
糖蜜原料本身有酸性的,也有碱性的,在黄血盐或其他方法处理前要根据不同的情况加以调节。为了得到较高和稳定的发酵产酸率,调酸度时还要考虑加热时间的影响。对于酸性原料,pH值应调得比碱性原料高些,因为它具有延时缓冲性,它配制的培养基在灭菌后会酸化,称为返酸,而碱性原料的性质正好相反。pH值调节一般用H2SO4或Na2CO3,参与调节范围为pH值6.0~7.2。
(2)发酵进入产酸期pH值的调节与控制。为了确保发酵的顺利进行,必须使其各个阶段经常处于最适pH值范围之内,这就需要在发酵过程中不断地调节和控制pH值的变化。正常发酵过程中,长菌期以后pH值的下降都能达到柠檬酸积累所希望的水平。如果达不到要求,还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加入酸(如H2SO4)或碱(如NaOH)来控制,现在常用的是以生理酸性物质(NH4)2SO4和生理碱性物质氨水来控制,它们不仅可以调节pH值,还可以补充氮源。
黑曲霉偏好于无机氮,当有机氮和无机氮同时存在时,它首先利用无机氮。在无机氮中,生理酸性氮比碱性氮好,这是因为生理酸性氮中铵离子被利用后,使培养基变酸,可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束,转入产酸阶段,pH值下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。因此,铵盐既可以调节代谢,也可以控制pH值。简单的有机氮比复杂的好,如尿素比氨基酸好,氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培养基上,NH4NO3是最好的氮源。黑曲霉以同样的速度消耗2种氮,所以培养基酸度不变。但糖蜜发酵培养基中还需添加少量NH4Cl。若原料中有机氮含量过于丰富,菌生长代谢加快,对缩短发酵周期有利,但是不利于柠檬酸积累,产酸率不高。这就是不能直接利用含蛋白质丰富的粗玉米粉的原因。
在柠檬酸发酵中途添加铵盐,尤其是当发酵中柠檬酸生成速度开始下降时,添加铵离子最为有利,且对菌体无影响,这种效应可能与铵离子对柠檬酸积累调节作用有关。近年来,我国采用高浓度薯干粉发酵,为缩短发酵周期,提高柠檬酸产酸速率,有时也添加0.01%~0.05%的(NH4)2SO4。
(3)发酵过程通风量对pH 值的调节作用。在薯干粉发酵中,黑曲霉还担负着糖化的任务,糖化的适宜pH 值在4.0左右,虽然工业上并不严格控制在4.0 水平,但在糖化基本完成之前,必须控制低风量使pH 值缓慢降到2.5,这个过程需16~18h。当产酸量加上还原糖量接近起始可发酵总量(其差比大于10g/h·L)时,则可以认为糖化已经完成,这时可适当加大风量使发酵进入产酸期。在产酸期内控制风量使产酸速率维持在2~3g/h·L,不得过快,以进一步利用糖化作用和防止菌体过早衰老。
(4)中和剂对发酵pH值调节的应用。为了防止pH值下降过快造成不利影响,也可以在发酵的第18~40h 加入少许CaCO3(5~10g/L)以中和酸度,但不得使pH 值超过3.0,否则会多产草酸。当用NH4+盐作为氮源时,可在培养基中加入CaCO3,用于中和NH4+被吸收后剩余的酸,但在操作中应注意控制染菌危险。
(5)发酵过程pH值的自动控制。柠檬酸深层发酵过程中,生产菌黑曲霉比生长速率和产物柠檬酸合成比生产速率分别有各自的最适宜pH值范围。因此,应分阶段控制生长最适pH值和产物最适pH值。可把检测的pH值结果输送到pH值控制器以指令加糖、加酸或加碱,实现自动控制,使发酵液的pH值控制在预定的数值。