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【中图分类号】R657 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2015）02
【摘要】虾青素是自然界发现的抗氧化能力最强的生物制剂，近几年来天然虾青素的国内外分离方法有很大发展，但主要集中在柱层析法和色谱法，本文对天然虾青素的分离纯化方法进行了综述。
【关键词】虾青素；柱层析法；高效液相色谱法
1 前言
天然虾青素（Astaxanthin，3，3-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’胡萝卜素），属于酮式类胡萝卜素，其分子式为C40H52O4，相对分子量为596.86[1]。虾青素由一个共轭多烯链及两个末端环状结构构成，由于烃链较长，极性较小，因此虾青素具脂溶性，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[2-4]。共轭多烯链中的烯键都可能为顺式或反式（cis-或trans-）构型，但由于顺式构型热力学上不稳定，在自然界中，反式构型占绝对优势，因此天然虾青素主要以反式构型存在[5]。
天然虾青素富含于虾蟹的壳、雨生红球藻、法夫酵母等，其中雨生红球藻是目前已知自然界中存在的虾青素含量最高的生物，可达1.5-3%。虾青素具有强抗氧化功能，清除氧自由基，抗癌，降糖降脂等多种生理功能，应用前景广泛。目前，虾青素已被应用于食品添加剂、水产品养殖、化妆品、保健品，医药等行业中，取得了巨大的经济效益[6]。
2 天然虾青素分离纯化工艺
天然虾青素由于其末端环上的羰基和羟基使得它有最高的抗氧化活性，它的游离形式及其不稳定，因此虾青素在生物体内通常与蛋白质结合，呈现出青、蓝色（例如虾蟹壳），或两端羟基也可不同程度地与脂肪酸形成虾青素酯（例如雨生红球藻或红发夫酵母）。从雨生红球藻、虾壳等中提取的粗色素油中虾青素主要以虾青素酯的形式存在，虽经过皂化后，但其虾青素酯并不能全部转化成虾青素，故皂化液中有虾青素和虾青素酯等其他类胡萝卜素化合物的共同存在[7]。要得到虾青素纯品，就有必要对其进一步分离纯化，目前国内外对天然虾青素的分离纯化研究主要集中在柱层析法和色谱法等。
2.1 重结晶法
重结晶是将物质溶于溶剂后又重新从溶剂中析出结晶的过程，利用混合物各组分在某种溶剂中溶解度不同或在同一溶剂中溶解度随温度的改变而发生变化的原理将各组分分离。重结晶法是一种分离纯化中常用的一种方法。
邹书慧[8]采用重结晶法纯化虾青素，将虾青素于二氯甲烷中溶解，过滤，再向溶液中加入无水乙醇，静置结晶，反复多次重结晶得到了暗紫色的纯虾青素。雷凤爱[5]也应用了二氯甲烷对虾青素进行反复溶解和重结晶，得到虾青素纯品。孙伟红等[9]在室温下浓缩蒸干虾青素提取液，加入丙酮约100ml溶解，氮气下吹扫，达到饱和状态，并有少量红棕色结晶析出，加入蒸馏水几滴，4 ℃下放置结晶72h，过滤并先后用蒸馏水和丙酮清洗两次，低温下真空干燥，得到晶体纯度为95%。
2.2 碳酸钠洗涤法
甲殼废水中含有虾青素，回收利用其中的虾青素，不仅可以增加经济效益，还可保护环境。虾青素在废水中与蛋白质通过化学键结合[10]，而碳酸钠可除去水溶性蛋白质，故可用碳酸钠洗涤法分离纯化甲壳废水中虾青素。
姜洪峰等[11]采用碳酸钠洗涤法纯化虾青素粗提品，取粗提品萃取液，加入0.025g/ml碳酸钠水溶液，25℃保温振摇洗涤6min，在4000r/min条件下离心5分钟，分离出有机相和水相。提纯后游离虾青素含量达6.94%，与未提纯样品相比，效果较好。
2.3 薄层层析法
薄层层析又称为薄层色谱，以硅胶等吸附剂铺在玻璃板上作为固定相，用展开剂将被测样品展开，从而分离样品中的各组分，可用比移值（Rf）鉴别化合物。薄层层析法可用于化合物的鉴别，也可用于化合物的分离。
赵仪[12]采用薄层层析法纯化虾壳虾青素，取多块薄板，带状点样，展开，展开剂为二硫化碳：乙酸乙酯=90：10。展开完全后，刮下与标样相同Rf值的斑点，用二氯甲烷洗脱，过滤，收集滤液。经高效液相色谱结合折光示差检测器检测，薄层层析法纯化得到的虾青素的纯度达到94.58%。
2.4 柱层析法
柱层析法又称为柱色谱法，是一种物理分离方法，用于多组分的混合物的分离纯化。它利用混合物中各组分物理化学性质的不同，使得各组分在固定相和流动相分配系数不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的[13]。
张琇等[14]采用聚酰胺柱层析法纯化虾青素，将溶于正己烷的虾青素粗品溶液沿柱壁缓慢加入层析柱中，先用正己烷洗脱，得到淡黄色馏分。然后按照正己烷：二氯甲烷=4：1、正己烷：二氯甲烷=2：1和二氯甲烷进行梯度洗脱，馏分的收集则根据HD-5电脑紫外检测仪检测的吸光度和洗脱液的颜色。各馏分在35℃，0.08MPa真空度的条件下浓缩。经HPLC检测，聚酰胺柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到92.9%。杨磊等[15]采用连续中压硅胶柱层析法纯化法夫酵母虾青素，层析柱采用湿法填充，将120～160μm层析硅胶装填于不锈钢中压层析柱中，洗脱剂为石油醚：1，2-二氯乙烷：丙酮为 5：2.5：1。将溶于丙酮的虾青素粗品溶液泵入层析柱柱头，再泵入洗脱剂洗脱，分批连续收集馏分。经HPLC检测，连续中压硅胶柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到97.3%。张晓燕[16]采用AB-8大孔树脂层析法分离纯化南极磷虾壳中的虾青素，取AB-8大孔树脂湿法装入玻璃层析柱中。以每小时1倍量柱体积的流速将皂化后的虾青素提取液上柱，待提取液完全流尽后，先后用二次水和8BV/h二氯甲烷进行洗脱，直至洗出液无色，收集洗脱液。经HPLC检测，AB-8大孔树脂层析法分离纯化得到的虾青素的纯度达到95.4%。欧阳琴[17]采用硅胶柱层析法纯化虾青素，固定相选用200～300目的硅胶，洗脱剂为丙酮：正己烷=25：75，待有色物质移动至柱底时，收集馏分，收集间隔时间为20min。经高效液相色谱结合折光示差检测器检测，硅胶柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到98.6%。 2.5高速逆流色谱法
高效逆流色谱是一种液-液分配色谱技术，其分离混合物中各组分的依据为各组分在两相中的分配系数不同，使流出速度不同而达到分离的目的。
Hua-Bin Li等[18]采用高效逆流色谱分离纯化雨生红球藻中的虾青素，液-液两相系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=5：5：6.5：3，在480nm波长下观察出峰情况，收集馏分，得到纯度为97%的虾青素。
2.6 制备型高效液相色谱法
制备型高效液相色谱法是一种高效的分离纯化方法，已被广泛应用于天然产物等物质的分离。
惠伯棣等[19]采用高效液相法分离虾青素，色谱柱：DiamonsilTM柱（5μm，4.6mm×25cm），流动相A为的乙腈-水（90：10）溶液，磷酸调节pH为3.0，流动相B为乙酸乙酯，进行线性梯度洗脱，流动相B的百分比在15min内由0%增加到70%，而15～25min内则维持在70%，检测波长为480nm，PDA的波长范围在280～580nm之间，进样量为20ml，流速为1.0ml/min。根据色谱图收集样品。
3 结语及展望
虾青素具有抗氧化、促进动物繁殖、防紫外线辐射、着色等多种生物学功能，口服虾青素制品可以预防诸如动脉硬化、白内障、心血管以及癌症等疾病的发生，可以增强机体免疫力[20]。虾青素具有很高的经济价值，因其强大的生物学功能以及安全、无毒副作用等优势被广泛应用于食品、化工、饲料等行业，特别是在医药方面有广泛的应用前景。目前虾青素制品的纯度远不能满足市场要求，因此加快虾青素产品的分离纯化研究，具有十分重要的意义。
参考文献
[1] 李浩明，高藍. 虾青素的结构、功能与应用[J]. 精细化工，2003，20（1）：32-37.
[2] 郑裕国，沈寅初. 虾青素生产技术及其应用[J]. 化工科技市场，2001，24（2）：24-25.
[3] 张明祥，赵建国. 国内外虾青素的研究进展[J]. 粮食与饲料工业，2002，（1）：26～28.
[4] Higuera-Ciapara I， Felix-Valenzuela L， Goycoolea F M. Astaxanthin： a review of its chemistry and applications[J]. Critical reviews in food science and nutrition， 2006，46（2）： 185-196.
[5] 雷凤爱. 雨生红球藻中虾青素的分离纯化及异构体的分析研究[D]. 内蒙古工业大学，2009.
[6] 李婷. 雨生红球藻中虾青素的提取及抗氧化活性研究[D]. 中国科学院研究生院，2011.
[7] 吴彩娟. 天然虾青素的提取及纯化工艺研究[D]. 浙江大学，2003.
[8] 邹书慧. 超临界CO2萃取雨生红球藻中虾青素等有效成分的研究[D]. 内蒙古工业大学，2009.
[9] 孙伟红，林洪，翟毓秀，等. 红发夫酵母中3R，3’R-虾青素的分离纯化和结构鉴定[J]. 食品科学，2014，35（11）：79～82.
[10] 葛立军. 甲壳废水中虾青素酶法提取工艺的研究[D]. 浙江工业大学，2003.
[11] 姜洪峰，钱俊青，杨兰花. 甲壳素废水絮凝物中虾青素提取纯化[J]. 浙江工业大学学报，2005，33（3）：324～340.
[12] 赵仪. 虾壳虾青素提取与纯化研究[D]. 福州大学，2006.
[13] 李军华. 柱层析法分离西洋参及人参发根中人参皂苷Rb1[D]. 吉林大学，2003.
[14] 张琇，钟丽晶，马爱瑛，等. 红酵母虾青素的分离与纯化初探[J]. 中国农学通报，2011，27（2）：405～409.
[15] 杨磊，卫蔚，刘婷婷，等. 连续中压硅胶柱层析纯化法夫酵母虾青素[J]. 化工进展，2010，29（6）：1125～1128.
[16] 张晓燕. 南极磷虾壳中虾青素提取纯化与纳米包载[D]. 中国海洋大学，2013.
[17] 欧阳琴. 雨生红球藻的培养及其虾青素提取[D]. 福州大学，2004.
[18] Li， H.B.， Chen， F.. Preparative isolation and purification of astaxanthin from the microalga Chlorococcum sp. by high-speed counter current hromatography[J] . Chromatogr. A 2001， 925：133–137.
[19] 惠伯棣，裴凌鹏，李京. 食品中虾青素的C18-HPLC-PDA分离与鉴定[J]. 食品工业科技，2006，27（8）：169～171.
[20] 姜启兴，夏文水. 龙虾壳中色素的稳定性研究[J]. 食品科学， 2006，27（7）： 61-64.
【摘要】虾青素是自然界发现的抗氧化能力最强的生物制剂，近几年来天然虾青素的国内外分离方法有很大发展，但主要集中在柱层析法和色谱法，本文对天然虾青素的分离纯化方法进行了综述。
【关键词】虾青素；柱层析法；高效液相色谱法
1 前言
天然虾青素（Astaxanthin，3，3-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’胡萝卜素），属于酮式类胡萝卜素，其分子式为C40H52O4，相对分子量为596.86[1]。虾青素由一个共轭多烯链及两个末端环状结构构成，由于烃链较长，极性较小，因此虾青素具脂溶性，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[2-4]。共轭多烯链中的烯键都可能为顺式或反式（cis-或trans-）构型，但由于顺式构型热力学上不稳定，在自然界中，反式构型占绝对优势，因此天然虾青素主要以反式构型存在[5]。
天然虾青素富含于虾蟹的壳、雨生红球藻、法夫酵母等，其中雨生红球藻是目前已知自然界中存在的虾青素含量最高的生物，可达1.5-3%。虾青素具有强抗氧化功能，清除氧自由基，抗癌，降糖降脂等多种生理功能，应用前景广泛。目前，虾青素已被应用于食品添加剂、水产品养殖、化妆品、保健品，医药等行业中，取得了巨大的经济效益[6]。
2 天然虾青素分离纯化工艺
天然虾青素由于其末端环上的羰基和羟基使得它有最高的抗氧化活性，它的游离形式及其不稳定，因此虾青素在生物体内通常与蛋白质结合，呈现出青、蓝色（例如虾蟹壳），或两端羟基也可不同程度地与脂肪酸形成虾青素酯（例如雨生红球藻或红发夫酵母）。从雨生红球藻、虾壳等中提取的粗色素油中虾青素主要以虾青素酯的形式存在，虽经过皂化后，但其虾青素酯并不能全部转化成虾青素，故皂化液中有虾青素和虾青素酯等其他类胡萝卜素化合物的共同存在[7]。要得到虾青素纯品，就有必要对其进一步分离纯化，目前国内外对天然虾青素的分离纯化研究主要集中在柱层析法和色谱法等。
2.1 重结晶法
重结晶是将物质溶于溶剂后又重新从溶剂中析出结晶的过程，利用混合物各组分在某种溶剂中溶解度不同或在同一溶剂中溶解度随温度的改变而发生变化的原理将各组分分离。重结晶法是一种分离纯化中常用的一种方法。
邹书慧[8]采用重结晶法纯化虾青素，将虾青素于二氯甲烷中溶解，过滤，再向溶液中加入无水乙醇，静置结晶，反复多次重结晶得到了暗紫色的纯虾青素。雷凤爱[5]也应用了二氯甲烷对虾青素进行反复溶解和重结晶，得到虾青素纯品。孙伟红等[9]在室温下浓缩蒸干虾青素提取液，加入丙酮约100ml溶解，氮气下吹扫，达到饱和状态，并有少量红棕色结晶析出，加入蒸馏水几滴，4 ℃下放置结晶72h，过滤并先后用蒸馏水和丙酮清洗两次，低温下真空干燥，得到晶体纯度为95%。
2.2 碳酸钠洗涤法
甲殼废水中含有虾青素，回收利用其中的虾青素，不仅可以增加经济效益，还可保护环境。虾青素在废水中与蛋白质通过化学键结合[10]，而碳酸钠可除去水溶性蛋白质，故可用碳酸钠洗涤法分离纯化甲壳废水中虾青素。
姜洪峰等[11]采用碳酸钠洗涤法纯化虾青素粗提品，取粗提品萃取液，加入0.025g/ml碳酸钠水溶液，25℃保温振摇洗涤6min，在4000r/min条件下离心5分钟，分离出有机相和水相。提纯后游离虾青素含量达6.94%，与未提纯样品相比，效果较好。
2.3 薄层层析法
薄层层析又称为薄层色谱，以硅胶等吸附剂铺在玻璃板上作为固定相，用展开剂将被测样品展开，从而分离样品中的各组分，可用比移值（Rf）鉴别化合物。薄层层析法可用于化合物的鉴别，也可用于化合物的分离。
赵仪[12]采用薄层层析法纯化虾壳虾青素，取多块薄板，带状点样，展开，展开剂为二硫化碳：乙酸乙酯=90：10。展开完全后，刮下与标样相同Rf值的斑点，用二氯甲烷洗脱，过滤，收集滤液。经高效液相色谱结合折光示差检测器检测，薄层层析法纯化得到的虾青素的纯度达到94.58%。
2.4 柱层析法
柱层析法又称为柱色谱法，是一种物理分离方法，用于多组分的混合物的分离纯化。它利用混合物中各组分物理化学性质的不同，使得各组分在固定相和流动相分配系数不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的[13]。
张琇等[14]采用聚酰胺柱层析法纯化虾青素，将溶于正己烷的虾青素粗品溶液沿柱壁缓慢加入层析柱中，先用正己烷洗脱，得到淡黄色馏分。然后按照正己烷：二氯甲烷=4：1、正己烷：二氯甲烷=2：1和二氯甲烷进行梯度洗脱，馏分的收集则根据HD-5电脑紫外检测仪检测的吸光度和洗脱液的颜色。各馏分在35℃，0.08MPa真空度的条件下浓缩。经HPLC检测，聚酰胺柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到92.9%。杨磊等[15]采用连续中压硅胶柱层析法纯化法夫酵母虾青素，层析柱采用湿法填充，将120～160μm层析硅胶装填于不锈钢中压层析柱中，洗脱剂为石油醚：1，2-二氯乙烷：丙酮为 5：2.5：1。将溶于丙酮的虾青素粗品溶液泵入层析柱柱头，再泵入洗脱剂洗脱，分批连续收集馏分。经HPLC检测，连续中压硅胶柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到97.3%。张晓燕[16]采用AB-8大孔树脂层析法分离纯化南极磷虾壳中的虾青素，取AB-8大孔树脂湿法装入玻璃层析柱中。以每小时1倍量柱体积的流速将皂化后的虾青素提取液上柱，待提取液完全流尽后，先后用二次水和8BV/h二氯甲烷进行洗脱，直至洗出液无色，收集洗脱液。经HPLC检测，AB-8大孔树脂层析法分离纯化得到的虾青素的纯度达到95.4%。欧阳琴[17]采用硅胶柱层析法纯化虾青素，固定相选用200～300目的硅胶，洗脱剂为丙酮：正己烷=25：75，待有色物质移动至柱底时，收集馏分，收集间隔时间为20min。经高效液相色谱结合折光示差检测器检测，硅胶柱层析法纯化得到的虾青素的纯度达到98.6%。 2.5高速逆流色谱法
高效逆流色谱是一种液-液分配色谱技术，其分离混合物中各组分的依据为各组分在两相中的分配系数不同，使流出速度不同而达到分离的目的。
Hua-Bin Li等[18]采用高效逆流色谱分离纯化雨生红球藻中的虾青素，液-液两相系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=5：5：6.5：3，在480nm波长下观察出峰情况，收集馏分，得到纯度为97%的虾青素。
2.6 制备型高效液相色谱法
制备型高效液相色谱法是一种高效的分离纯化方法，已被广泛应用于天然产物等物质的分离。
惠伯棣等[19]采用高效液相法分离虾青素，色谱柱：DiamonsilTM柱（5μm，4.6mm×25cm），流动相A为的乙腈-水（90：10）溶液，磷酸调节pH为3.0，流动相B为乙酸乙酯，进行线性梯度洗脱，流动相B的百分比在15min内由0%增加到70%，而15～25min内则维持在70%，检测波长为480nm，PDA的波长范围在280～580nm之间，进样量为20ml，流速为1.0ml/min。根据色谱图收集样品。
3 结语及展望
虾青素具有抗氧化、促进动物繁殖、防紫外线辐射、着色等多种生物学功能，口服虾青素制品可以预防诸如动脉硬化、白内障、心血管以及癌症等疾病的发生，可以增强机体免疫力[20]。虾青素具有很高的经济价值，因其强大的生物学功能以及安全、无毒副作用等优势被广泛应用于食品、化工、饲料等行业，特别是在医药方面有广泛的应用前景。目前虾青素制品的纯度远不能满足市场要求，因此加快虾青素产品的分离纯化研究，具有十分重要的意义。
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[12] 赵仪. 虾壳虾青素提取与纯化研究[D]. 福州大学，2006.
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