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摘要：目的 探討湖北海棠总黄酮、根皮苷、复方鳖甲软肝片对日本血吸虫所致小鼠肝纤维化的保护作用。方法 随机将感染日本血吸虫尾蚴小鼠分成5组，模型组（B）， 复方鳖甲软肝片阳性组（C），湖北海棠总黄酮治疗高剂量组114 mg/（㎏.d），根皮苷组 （E） 40 mg/（㎏.d），另设空白组（A），每组10只。感染后第42天， C、D、E组均用吡喹酮驱虫治疗500mg/（㎏.d）×2d，之后各组开始灌胃给药持续治疗60天，A组和B组用生理盐水对照。实验结束处死小鼠，留取肝脏组织和血清，测定血清中ALT、AST、HA的含量;计算肝体指数;测定肝组织中HYP含量;苏木素-伊红及Masson胶原纤维染色观察小鼠肝组织变性、虫卵肉芽肿与胶原沉积等病理改变。结果 与空白A组相比，B、C、D、E组小鼠肝脏有明显虫卵肉芽肿形成、胶原沉积与肝纤维化，伴有不同程度的肝细胞炎性损伤坏死;血清中ALT、AST、HA和肝组织中HYP含量均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组B相比，湖北海棠总黄酮、根皮苷、复方鳖甲软肝片均能明显降低ALT、AST、HA和HYP含量及肝指数（P<0.05或P<0.01）;明显减轻小鼠肝组织坏死与胶原沉积，减轻虫卵肉芽肿的面积，三种药物之间差异性不明显。结论 湖北海棠总黄酮和根皮苷具有抗血吸虫肝纤维化的作用。
关键词：湖北海棠总黄酮;根皮苷;复方鳖甲软肝片;日本血吸虫;肝纤维化;
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）07--02
血吸虫性肝硬化是血吸虫虫卵沉积在肝脏，可溶性虫卵抗原引起的、以肝虫卵肉芽肿和肝纤维化为特点的免疫疾病[1]。研究表明，吡喹酮治疗后未成熟虫卵仍可继续发育，虫卵肉芽肿反应仍在继续，而且一旦肝纤维化达到一定程度，即使去除诱因，肝纤维化仍将继续。因此在虫卵肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期如何用药物干预、控制其发展，成为吡喹酮治疗后控制血吸虫性肝病发展的关键。然而至今尚无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。
湖北海棠（Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.）为蔷薇科苹果属植物，又名野海棠，花红茶。主要分布在湖北、湖南、江西、江苏、浙江、安徽等地[2]。湖北海棠嫩叶作茶叶饮用己有400多年的饮用历史，是三峡地区夏季广为饮用的清凉饮料，俗称林擒茶[3] 。据研究，湖北海棠叶富含以根皮苷为主的黄酮类物质和Zn、Cr、Mn等多种矿物质[4]，具有降血糖、保肝护肝、抗病毒等作用，主要用于治疗慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝损伤、高血糖、高血脂等[5]。本课题旨在研究湖北海棠叶总黄酮及根皮苷对血吸虫感染所致虫卵肉芽肿和肝纤维化的抑制作用，为湖北海棠叶在保肝护肝功能方面开发应用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1药物及试剂
湖北海棠总黄酮：由天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学）提供，80℃温水浸提湖北海棠叶三次，每次1h，合并浸提液过滤，上大孔树脂柱用蒸馏水冲洗至流出液糖检测阴性，用50%乙醇一次性洗出，回收溶剂并减压干燥，得湖北海棠总黄酮，其主要成分为根皮苷，其含量为70%;根皮苷从湖北海棠总黄酮中抽提纯化，纯度98%;复方鳖甲软肝片，内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号：20090625。吡喹酮片，南京制药厂有限公司，批号：20090704。丙氨酸氨基转移酶（ALT） 、天门冬氨酸氨基转移酶（AST），羟脯氨酸（HYP）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，小鼠血清透明质酸（HA）ELISA试剂盒，上海研吉生物科技有限公司提供的美国R&D systems产品;其他试剂皆为分析纯。
1.2实验动物及钉螺
6～8周龄清洁级昆明种小鼠60只， 雌雄各半，体重20士2g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物生产许可证号为：SCXK（鄂）2009-0007;将动物置于室温25℃环境下，饲养笼饲养，自由饮水，以全价颗粒饲料喂养[3]。感染中国大陆株日本血吸虫尾蚴的阳性钉螺，购自江西省寄生虫病防治研究所。
2 方法
2.1感染及分组
按常规将钉螺放入去氯离子自来水中逸出尾蚴，将50只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40～50条/只，然后随机分成5组：模型组（B）; 复方鳖甲软肝片（C）;湖北海棠总黄酮组（D）、根皮苷（E）;另外10只未感染小鼠为空白组（A）。于感染后第42天，B、C、D、E组均给予吡喹酮灌胃治疗：500mg/（㎏.d）×2d，A组以生理盐水灌胃对照。接着C组给予灌胃复方鳖甲软肝片1000mg/（㎏.d）×60d，D组灌胃湖北海棠总黄酮114 mg/（㎏.d）×60d，E组灌胃根皮苷40 mg/（㎏.d）×60d， A组和B组均以生理盐水作为对照灌胃。
2.2检测指标和方法
2.2.1血清样品的收集
末次给药后，禁食不禁水过夜，24小时后摘眼球取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST的水平，ELISA法检测血清中HA的含量，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。
2.2.2肝组织样品处理
取小鼠肝脏，用4℃预冷的生理盐水冲尽表面浮血，滤纸拭干、称重，按肝体指数=[肝脏重量（g）/体重（g）]×100公式计算小鼠肝体指数;然后取小鼠肝脏右叶同一部位切成4mm薄片， 4%中性甲醛固定，石蜡包埋，制作厚4μm 连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肝组织中虫卵肉芽肿的大小;胶原纤维染色（Masson染色），光镜观察胶原沉积情况，并应用图像分析系统计算胶原纤维的面积。每只小鼠做一张切片，每张切片随机取5个视野，计算每个视野中蓝色胶原分布的面积，其和为该切片纤维化面积，用于判断肝纤维化程度;另取肝组织0.1g测定其中HYP的含量，操作方法按照HYP试剂盒说明书进行。 2.2.3数据处理
所有数据均以均数±标准差（ ）表示，统计方法采用单因素方差分析，统计数据采用SPSS 13.0处理。
3结果
3.1血清HA、ALT、AST含量
与空白组A相比，模型组B和各治疗组C、D、E血清中HA、ALT、AST含量均升高，其中模型组最高。而C、D、E组与模型组B相比，总黄酮、根皮苷和鳖甲软肝片均能显著降低血清中ALT、AST、HA含量（P<0.05或，P<0.01）。（见表1）
3.2 肝组织中HYP含量
空白组A中HYP含量极低，模型组B和各治疗组C、D、E肝组织中HYP含量均明显升高，其中模型组最高。而C、D、E组与模型组B相比，总黄酮、根皮苷和鳖甲软肝片均能显著降低肝组织中HYP含量（P<0.05或P<0.01），也能明显降低小鼠的肝体指数（P<0.05或P<0.01）。（见表1）
3.3 肝脏组织病理变化
A组（空白组）小鼠肝脏表面光滑，红褐色，镜下见肝细胞沿肝小叶呈放射状分布，Masson染色未见蓝色胶原沉积。B组（模型组）小鼠肝脏明显增大，表面布满大小不一的灰白色的颗粒，镜下见大量虫卵肉芽肿。汇管区及虫卵肉芽肿周围纤维增生明显，大部分虫卵肉芽肿出现坏死病灶及纤维化，肝血窦扩张充血，大量炎性细胞浸润。虫卵肉芽肿周围以及汇管区大量蓝色胶原沉积。C、D、E组小鼠肝脏轻微增大，质地中等，表面灰白色结节明显少于B组，镜下虫卵肉芽肿的面积和数量明显减小，蓝色胶原沉积的面积明显低于模型组，肝纤维化程度明显降低。C、D、E之间差异不显著（见表1）。
4讨论
肝脏的纤维化是纤维增生和分解不平衡导致肝纤维组织过度沉积的结果。反复或持续的肝损伤或炎性病变，可使细胞外基质（ECM） 合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化。肝星状细胞（HSC）是目前被公认的ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节[6]。血清HA是反映肝细胞细胞外基质代谢的血清学指标，与肝纤维化程度有明显的相关性。HA为糖胺多糖类物质，在肝内由HSC合成并释放入血循环中，而肝细胞可清除和降低循环血液中HA。肝纤维化时，由于HSC的增殖和激活以及肝细胞的功能下降，致使HA不但合成增加，而且清除率下降。所以，HA是反映肝纤维化的敏感指标也可反应肝纤维化程度[7-8]。
近来的研究报道显示海棠总黄酮对慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝损伤等有很好的保护作用，总黄酮中主要的活性充分是根皮苷。本实验通过建立血吸虫感染性肝纤维化模型，给予湖北海棠总黄酮和根皮苷治疗后，结果显示其总黄酮和根皮苷均能明显改善日本血吸虫感染引起的肝脏病理变化，减小肝脏虫卵肉芽肿面积，降低肝脏组织中HYP含量，减少胶原纤维在肝脏组织中沉积，且降低血清中ALT、AST、HA的水平，对血吸虫性肝纤维化有确切的治疗效果，且两组之间差异不显著，证明在抑制肝纤维化过程中，起主要作用的是根皮苷。复方鳖甲软肝片是目前临床用于治疗肝纤维化的中成药，湖北海棠总黄酮和根皮苷在改善肝纤维化中的作用与复方鳖甲软肝片相比效果相当，其作用机制可能与降低血清中透明质酸酶的含量有关。
作者认为，湖北海棠叶总黄酮及其纯化产物根皮苷可以作为吡喹酮治疗血吸虫病的辅助用药，用吡喹酮有效杀虫治疗的同时，如能尽早服用湖北海棠总黄酮或根皮苷，有可能改善血吸虫病患者肝纤维化的预后。且湖北海棠经济实惠，具有开发利用价值。
参考文献：
[1]Boros DL. Immunopathology of schistosoma mansoni infection. [J]. Clin Microbiol Rec， 1989， 2：250-259
[2] 中国科学院武汉植物研究所编. 湖北植物志 [M]. 武汉市： 湖北科学技术出版社，2002
[3] 方荣，杨茜，李莉，等. 湖北海棠中根皮苷含量测定[J]. 食品科技， 2008，（6） 195-196
[4] 冯雪娇，曹学丽，李艳，等. 根皮苷的应用及分离纯化研究进展[J]. 北京工商大学学报（自然科学版）， 2008， 26（4）： 13-16
[5] 王春玲，王鹏，张占伟. 湖北海棠对小鼠血糖的影响[J]. 基层中药杂志，1999，13 （2）： 19-20
[6] Friedman SL. Mechanisms of Disease： mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. [J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol， 2004， 1： 98-105.
[7] Massart C， Bendavid C， Gibassier J， et al. Importance of the functional sensitivity determination of a serum hyaluronic acid assay for the prediction of liver fibrosis in patient s with feature of the metabolic syndrome [J].Clin Chem Lab Med，2006， 44 （4）：505-507.
[8] Kopke-Aguiar LA， Martins JR， Passerotti CC， et al. Serum hyaluronic acid as a comprehensive marker to assess severity of liver disease in schistosomiasis[J] . Acta Trop， 2002， 84： 117-126.
作者簡介：杜幼芹（1972-），女，汉族，硕士，副教授，主要研究方向：寄生虫感染免疫。
关键词：湖北海棠总黄酮;根皮苷;复方鳖甲软肝片;日本血吸虫;肝纤维化;
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）07--02
血吸虫性肝硬化是血吸虫虫卵沉积在肝脏，可溶性虫卵抗原引起的、以肝虫卵肉芽肿和肝纤维化为特点的免疫疾病[1]。研究表明，吡喹酮治疗后未成熟虫卵仍可继续发育，虫卵肉芽肿反应仍在继续，而且一旦肝纤维化达到一定程度，即使去除诱因，肝纤维化仍将继续。因此在虫卵肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期如何用药物干预、控制其发展，成为吡喹酮治疗后控制血吸虫性肝病发展的关键。然而至今尚无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。
湖北海棠（Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.）为蔷薇科苹果属植物，又名野海棠，花红茶。主要分布在湖北、湖南、江西、江苏、浙江、安徽等地[2]。湖北海棠嫩叶作茶叶饮用己有400多年的饮用历史，是三峡地区夏季广为饮用的清凉饮料，俗称林擒茶[3] 。据研究，湖北海棠叶富含以根皮苷为主的黄酮类物质和Zn、Cr、Mn等多种矿物质[4]，具有降血糖、保肝护肝、抗病毒等作用，主要用于治疗慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝损伤、高血糖、高血脂等[5]。本课题旨在研究湖北海棠叶总黄酮及根皮苷对血吸虫感染所致虫卵肉芽肿和肝纤维化的抑制作用，为湖北海棠叶在保肝护肝功能方面开发应用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1药物及试剂
湖北海棠总黄酮：由天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学）提供，80℃温水浸提湖北海棠叶三次，每次1h，合并浸提液过滤，上大孔树脂柱用蒸馏水冲洗至流出液糖检测阴性，用50%乙醇一次性洗出，回收溶剂并减压干燥，得湖北海棠总黄酮，其主要成分为根皮苷，其含量为70%;根皮苷从湖北海棠总黄酮中抽提纯化，纯度98%;复方鳖甲软肝片，内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号：20090625。吡喹酮片，南京制药厂有限公司，批号：20090704。丙氨酸氨基转移酶（ALT） 、天门冬氨酸氨基转移酶（AST），羟脯氨酸（HYP）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，小鼠血清透明质酸（HA）ELISA试剂盒，上海研吉生物科技有限公司提供的美国R&D systems产品;其他试剂皆为分析纯。
1.2实验动物及钉螺
6～8周龄清洁级昆明种小鼠60只， 雌雄各半，体重20士2g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，动物生产许可证号为：SCXK（鄂）2009-0007;将动物置于室温25℃环境下，饲养笼饲养，自由饮水，以全价颗粒饲料喂养[3]。感染中国大陆株日本血吸虫尾蚴的阳性钉螺，购自江西省寄生虫病防治研究所。
2 方法
2.1感染及分组
按常规将钉螺放入去氯离子自来水中逸出尾蚴，将50只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40～50条/只，然后随机分成5组：模型组（B）; 复方鳖甲软肝片（C）;湖北海棠总黄酮组（D）、根皮苷（E）;另外10只未感染小鼠为空白组（A）。于感染后第42天，B、C、D、E组均给予吡喹酮灌胃治疗：500mg/（㎏.d）×2d，A组以生理盐水灌胃对照。接着C组给予灌胃复方鳖甲软肝片1000mg/（㎏.d）×60d，D组灌胃湖北海棠总黄酮114 mg/（㎏.d）×60d，E组灌胃根皮苷40 mg/（㎏.d）×60d， A组和B组均以生理盐水作为对照灌胃。
2.2检测指标和方法
2.2.1血清样品的收集
末次给药后，禁食不禁水过夜，24小时后摘眼球取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清中ALT和AST的水平，ELISA法检测血清中HA的含量，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。
2.2.2肝组织样品处理
取小鼠肝脏，用4℃预冷的生理盐水冲尽表面浮血，滤纸拭干、称重，按肝体指数=[肝脏重量（g）/体重（g）]×100公式计算小鼠肝体指数;然后取小鼠肝脏右叶同一部位切成4mm薄片， 4%中性甲醛固定，石蜡包埋，制作厚4μm 连续切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肝组织中虫卵肉芽肿的大小;胶原纤维染色（Masson染色），光镜观察胶原沉积情况，并应用图像分析系统计算胶原纤维的面积。每只小鼠做一张切片，每张切片随机取5个视野，计算每个视野中蓝色胶原分布的面积，其和为该切片纤维化面积，用于判断肝纤维化程度;另取肝组织0.1g测定其中HYP的含量，操作方法按照HYP试剂盒说明书进行。 2.2.3数据处理
所有数据均以均数±标准差（ ）表示，统计方法采用单因素方差分析，统计数据采用SPSS 13.0处理。
3结果
3.1血清HA、ALT、AST含量
与空白组A相比，模型组B和各治疗组C、D、E血清中HA、ALT、AST含量均升高，其中模型组最高。而C、D、E组与模型组B相比，总黄酮、根皮苷和鳖甲软肝片均能显著降低血清中ALT、AST、HA含量（P<0.05或，P<0.01）。（见表1）
3.2 肝组织中HYP含量
空白组A中HYP含量极低，模型组B和各治疗组C、D、E肝组织中HYP含量均明显升高，其中模型组最高。而C、D、E组与模型组B相比，总黄酮、根皮苷和鳖甲软肝片均能显著降低肝组织中HYP含量（P<0.05或P<0.01），也能明显降低小鼠的肝体指数（P<0.05或P<0.01）。（见表1）
3.3 肝脏组织病理变化
A组（空白组）小鼠肝脏表面光滑，红褐色，镜下见肝细胞沿肝小叶呈放射状分布，Masson染色未见蓝色胶原沉积。B组（模型组）小鼠肝脏明显增大，表面布满大小不一的灰白色的颗粒，镜下见大量虫卵肉芽肿。汇管区及虫卵肉芽肿周围纤维增生明显，大部分虫卵肉芽肿出现坏死病灶及纤维化，肝血窦扩张充血，大量炎性细胞浸润。虫卵肉芽肿周围以及汇管区大量蓝色胶原沉积。C、D、E组小鼠肝脏轻微增大，质地中等，表面灰白色结节明显少于B组，镜下虫卵肉芽肿的面积和数量明显减小，蓝色胶原沉积的面积明显低于模型组，肝纤维化程度明显降低。C、D、E之间差异不显著（见表1）。
4讨论
肝脏的纤维化是纤维增生和分解不平衡导致肝纤维组织过度沉积的结果。反复或持续的肝损伤或炎性病变，可使细胞外基质（ECM） 合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化。肝星状细胞（HSC）是目前被公认的ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节[6]。血清HA是反映肝细胞细胞外基质代谢的血清学指标，与肝纤维化程度有明显的相关性。HA为糖胺多糖类物质，在肝内由HSC合成并释放入血循环中，而肝细胞可清除和降低循环血液中HA。肝纤维化时，由于HSC的增殖和激活以及肝细胞的功能下降，致使HA不但合成增加，而且清除率下降。所以，HA是反映肝纤维化的敏感指标也可反应肝纤维化程度[7-8]。
近来的研究报道显示海棠总黄酮对慢性肝炎、脂肪肝、急慢性肝损伤等有很好的保护作用，总黄酮中主要的活性充分是根皮苷。本实验通过建立血吸虫感染性肝纤维化模型，给予湖北海棠总黄酮和根皮苷治疗后，结果显示其总黄酮和根皮苷均能明显改善日本血吸虫感染引起的肝脏病理变化，减小肝脏虫卵肉芽肿面积，降低肝脏组织中HYP含量，减少胶原纤维在肝脏组织中沉积，且降低血清中ALT、AST、HA的水平，对血吸虫性肝纤维化有确切的治疗效果，且两组之间差异不显著，证明在抑制肝纤维化过程中，起主要作用的是根皮苷。复方鳖甲软肝片是目前临床用于治疗肝纤维化的中成药，湖北海棠总黄酮和根皮苷在改善肝纤维化中的作用与复方鳖甲软肝片相比效果相当，其作用机制可能与降低血清中透明质酸酶的含量有关。
作者认为，湖北海棠叶总黄酮及其纯化产物根皮苷可以作为吡喹酮治疗血吸虫病的辅助用药，用吡喹酮有效杀虫治疗的同时，如能尽早服用湖北海棠总黄酮或根皮苷，有可能改善血吸虫病患者肝纤维化的预后。且湖北海棠经济实惠，具有开发利用价值。
参考文献：
[1]Boros DL. Immunopathology of schistosoma mansoni infection. [J]. Clin Microbiol Rec， 1989， 2：250-259
[2] 中国科学院武汉植物研究所编. 湖北植物志 [M]. 武汉市： 湖北科学技术出版社，2002
[3] 方荣，杨茜，李莉，等. 湖北海棠中根皮苷含量测定[J]. 食品科技， 2008，（6） 195-196
[4] 冯雪娇，曹学丽，李艳，等. 根皮苷的应用及分离纯化研究进展[J]. 北京工商大学学报（自然科学版）， 2008， 26（4）： 13-16
[5] 王春玲，王鹏，张占伟. 湖北海棠对小鼠血糖的影响[J]. 基层中药杂志，1999，13 （2）： 19-20
[6] Friedman SL. Mechanisms of Disease： mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. [J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol， 2004， 1： 98-105.
[7] Massart C， Bendavid C， Gibassier J， et al. Importance of the functional sensitivity determination of a serum hyaluronic acid assay for the prediction of liver fibrosis in patient s with feature of the metabolic syndrome [J].Clin Chem Lab Med，2006， 44 （4）：505-507.
[8] Kopke-Aguiar LA， Martins JR， Passerotti CC， et al. Serum hyaluronic acid as a comprehensive marker to assess severity of liver disease in schistosomiasis[J] . Acta Trop， 2002， 84： 117-126.
作者簡介：杜幼芹（1972-），女，汉族，硕士，副教授，主要研究方向：寄生虫感染免疫。