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摘要 番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus（TSWV）是严重危害世界经济作物的一种病毒，寄主范围广泛。我们在研究中发现番茄斑萎病毒能侵染我国大蒜Allium sativum L.。利用摩擦接种法将TSWV接种到健康大蒜上，结果显示：接种14 d后大蒜新生叶片出现褪绿和白色斑点症状。ELISA检测显示大蒜叶片汁液与TSWV的单克隆抗体产生血清学反应，采用TSWV N基因的引物对大蒜叶片总RNA进行RTPCR，结果扩增出约800 bp的条带，在NCBI上BLAST显示与TSWV YN5576的同源性最高，为98.52%。这些数据表明番茄斑萎病毒系统侵染我国大蒜。
关键词 番茄斑萎病毒; 大蒜; 鉴定; RTPCR
中图分类号： S 436.33
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018266
Abstract Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV） causes severe damages to economic crops worldwide， and it can infect a wide range of plant hosts. To determine whether TSWV infect Chinese garlic， the extracts of Nicotiana benthamiana leaves that were infected with TSWV were rubinoculated to garlic plants. Garlic plants showed chlorotic and white spot symptoms on new leaves at 14 d post inoculation. Then the garlic leaves were detected by ELISA and RTPCR.Positive results were obtained in the DotELISA of the garlic leaf extracts with monoclonal antibody of TSWV. Furthermore， the target fragments of 800 bp were obtained from all infected garlic leaves by RTPCR using the specific primers for N gene of TSWV. The sequence of the RTPCR products from infected garlic leave was analyzed at NCBI， and the results showed that it shared 98.52% of nucleic acids with TSWV YN5576 isolate. Therefore， our results showed that Chinese garlic could be infected by TSWV.
Key words Tomato spotted wilt tospovirus; garlic; identification; RTPCR
番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV）屬于番茄斑萎病毒科Tospoviridae， 番茄斑萎病毒属Orthotospovirus，是世界上最具经济危害性的十种病毒之一[1]。TSWV病毒粒子为直径80～100 nm的球形[2]，基因组由3个单链RNA组成，根据分子量的大小从大到小分别为 L RNA（8.9 kb）、 M RNA（4.8 kb）和 S RNA（2.9 kb）[34]。TSWV可以感染84个科1 090种植物，其中包括辣椒、番茄、茄子等农作物，对农业生产造成严重威胁[5]。感染TSWV的植物症状包括：叶片叶面皱缩、出现圆环状斑点，严重者叶片坏死脱落;根部和茎秆坏死;植株矮小等[6]。TSWV通过蓟马传播，主要通过西花蓟马Frankliniella occidentalis以持续循环增殖的方式传播。蓟马在1龄若虫时期获毒，成虫时期传毒[2]。
大蒜Allium sativum L.属于百合科Liliaceae葱属Allium。我国是世界上最大的大蒜生产国和出口国，现在大蒜主要分布在山东、河南、云南、四川、江苏等省。已报道的侵染大蒜的病毒主要属于3个病毒属，分别是马铃薯Y病毒属Potyvirus、香石竹潜隐病毒属Carlavirus和青葱X病毒属Allexivirus，且多为复合侵染，国外已有报道表明TSWV能够侵染大蒜[7]，但能否侵染中国大蒜尚未有报道。
我们在研究中发现番茄斑萎病毒能侵染中国大蒜。为了确定TSWV确实能感染中国大蒜，我们通过汁液摩擦接种的方式对大蒜进行接种，观察其症状，进而通过免疫学、分子生物学的方法对其进行研究，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大蒜：播种在温室中，温度控制在27℃±1℃、相对湿度75%±5%、光照周期 L∥D=16 h∥8 h，不喷洒农药且保持无病虫害状态。待植株10 cm高（约两周）时供试。
1.2 汁液摩擦接种
采用人工汁液摩擦接种的方法接种番茄斑萎病毒（TSWV）：选取发病明显的本氏烟植株，取顶部发病叶片约1 g，加入10 mL接种缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 7.0），研磨充分，在大蒜叶片顶端撒上金刚砂粉末（约500目），用棉签蘸取配好的接种液顺着叶脉伸展方向轻轻摩擦叶片，过约10 min用清水将摩擦过的叶片清洗干净，共接种10株大蒜，以摩擦接种缓冲液作为对照。过2～3周观察发病状况。 1.3 TSWV的ELISA检测
选取发病明显的4株大蒜，从顶部新叶叶片取0.1 g组织，加入PBS缓冲液500 μL，旋涡振荡40 s，4℃下8 000 g离心3 min，取上清液。采用上海恒远生物科技有限公司TSWV ELISA Kit进行检测。对照设置：取感染TSWV的本氏烟叶片作为阳性对照，接种缓冲液的健康大蒜为阴性对照。
1.4 TSWV的分子生物学鉴定
选取发病明显的4株大蒜，从顶部新叶叶片取01 g组织，采用TRIzol法提取总RNA。取5 μL RNA作为模板，采用诺唯赞生物技术公司两步法RTPCR/qPCR试剂盒合成cDNA。体系20 μL： RNAasefree ddH2O 2 μL，RNA模板5 μL，Random hexamers 1 μL，2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL。反应程序：50℃ 45 min;85℃ 2 min。
以扩增TSWV N基因的特异引物TSWVNF2037：5′CTGCTTTYAAGCAAGTTCTGC3′与TSWVNR2825：5′ATCATCATGTCTAAGGTTAAGCTC3′对TSWV的核衣壳蛋白N基因进行扩增[8]。PCR反应体系50 μL：cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL，5×SF Buffer 10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各2 μL，Phanta SuperFidelity DNA Polymerase 1 μL。反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性10 s，50℃退火30 s;72℃延伸50 s，30個循环;72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。根据凝胶成像仪的结果，用OMEGA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，并送生工生物工程有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 接种TSWV后症状观察
2.2 TSWV的ELISA检测
如表1所示，经空白对照调零后，阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照孔平均值≤0.10;说明试验有效。大蒜样品满足OD值高于临界值（CUT OFF）（临界值=阴性对照孔平均值 0.15）和I/H值
关键词 番茄斑萎病毒; 大蒜; 鉴定; RTPCR
中图分类号： S 436.33
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018266
Abstract Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV） causes severe damages to economic crops worldwide， and it can infect a wide range of plant hosts. To determine whether TSWV infect Chinese garlic， the extracts of Nicotiana benthamiana leaves that were infected with TSWV were rubinoculated to garlic plants. Garlic plants showed chlorotic and white spot symptoms on new leaves at 14 d post inoculation. Then the garlic leaves were detected by ELISA and RTPCR.Positive results were obtained in the DotELISA of the garlic leaf extracts with monoclonal antibody of TSWV. Furthermore， the target fragments of 800 bp were obtained from all infected garlic leaves by RTPCR using the specific primers for N gene of TSWV. The sequence of the RTPCR products from infected garlic leave was analyzed at NCBI， and the results showed that it shared 98.52% of nucleic acids with TSWV YN5576 isolate. Therefore， our results showed that Chinese garlic could be infected by TSWV.
Key words Tomato spotted wilt tospovirus; garlic; identification; RTPCR
番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV）屬于番茄斑萎病毒科Tospoviridae， 番茄斑萎病毒属Orthotospovirus，是世界上最具经济危害性的十种病毒之一[1]。TSWV病毒粒子为直径80～100 nm的球形[2]，基因组由3个单链RNA组成，根据分子量的大小从大到小分别为 L RNA（8.9 kb）、 M RNA（4.8 kb）和 S RNA（2.9 kb）[34]。TSWV可以感染84个科1 090种植物，其中包括辣椒、番茄、茄子等农作物，对农业生产造成严重威胁[5]。感染TSWV的植物症状包括：叶片叶面皱缩、出现圆环状斑点，严重者叶片坏死脱落;根部和茎秆坏死;植株矮小等[6]。TSWV通过蓟马传播，主要通过西花蓟马Frankliniella occidentalis以持续循环增殖的方式传播。蓟马在1龄若虫时期获毒，成虫时期传毒[2]。
大蒜Allium sativum L.属于百合科Liliaceae葱属Allium。我国是世界上最大的大蒜生产国和出口国，现在大蒜主要分布在山东、河南、云南、四川、江苏等省。已报道的侵染大蒜的病毒主要属于3个病毒属，分别是马铃薯Y病毒属Potyvirus、香石竹潜隐病毒属Carlavirus和青葱X病毒属Allexivirus，且多为复合侵染，国外已有报道表明TSWV能够侵染大蒜[7]，但能否侵染中国大蒜尚未有报道。
我们在研究中发现番茄斑萎病毒能侵染中国大蒜。为了确定TSWV确实能感染中国大蒜，我们通过汁液摩擦接种的方式对大蒜进行接种，观察其症状，进而通过免疫学、分子生物学的方法对其进行研究，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大蒜：播种在温室中，温度控制在27℃±1℃、相对湿度75%±5%、光照周期 L∥D=16 h∥8 h，不喷洒农药且保持无病虫害状态。待植株10 cm高（约两周）时供试。
1.2 汁液摩擦接种
采用人工汁液摩擦接种的方法接种番茄斑萎病毒（TSWV）：选取发病明显的本氏烟植株，取顶部发病叶片约1 g，加入10 mL接种缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 7.0），研磨充分，在大蒜叶片顶端撒上金刚砂粉末（约500目），用棉签蘸取配好的接种液顺着叶脉伸展方向轻轻摩擦叶片，过约10 min用清水将摩擦过的叶片清洗干净，共接种10株大蒜，以摩擦接种缓冲液作为对照。过2～3周观察发病状况。 1.3 TSWV的ELISA检测
选取发病明显的4株大蒜，从顶部新叶叶片取0.1 g组织，加入PBS缓冲液500 μL，旋涡振荡40 s，4℃下8 000 g离心3 min，取上清液。采用上海恒远生物科技有限公司TSWV ELISA Kit进行检测。对照设置：取感染TSWV的本氏烟叶片作为阳性对照，接种缓冲液的健康大蒜为阴性对照。
1.4 TSWV的分子生物学鉴定
选取发病明显的4株大蒜，从顶部新叶叶片取01 g组织，采用TRIzol法提取总RNA。取5 μL RNA作为模板，采用诺唯赞生物技术公司两步法RTPCR/qPCR试剂盒合成cDNA。体系20 μL： RNAasefree ddH2O 2 μL，RNA模板5 μL，Random hexamers 1 μL，2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL。反应程序：50℃ 45 min;85℃ 2 min。
以扩增TSWV N基因的特异引物TSWVNF2037：5′CTGCTTTYAAGCAAGTTCTGC3′与TSWVNR2825：5′ATCATCATGTCTAAGGTTAAGCTC3′对TSWV的核衣壳蛋白N基因进行扩增[8]。PCR反应体系50 μL：cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL，5×SF Buffer 10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各2 μL，Phanta SuperFidelity DNA Polymerase 1 μL。反应条件为95℃预变性3 min;95℃变性10 s，50℃退火30 s;72℃延伸50 s，30個循环;72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。根据凝胶成像仪的结果，用OMEGA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，并送生工生物工程有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 接种TSWV后症状观察
2.2 TSWV的ELISA检测
如表1所示，经空白对照调零后，阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照孔平均值≤0.10;说明试验有效。大蒜样品满足OD值高于临界值（CUT OFF）（临界值=阴性对照孔平均值 0.15）和I/H值