【摘 要】
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目的构建miR-34a慢病毒表达质粒,并检测其对人结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法以hsa-miR-34a前体序列pre-miR-34a为模板,设计末端部分互补的引物,进行引物退火反应,形成引物
【机 构】
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重庆医科大学附属第一医院胃肠外科;
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目的构建miR-34a慢病毒表达质粒,并检测其对人结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法以hsa-miR-34a前体序列pre-miR-34a为模板,设计末端部分互补的引物,进行引物退火反应,形成引物二聚体,进行PCR扩增,再以此DNA双链为模板进行PCR扩增,PCR产物酶切后,插入线性化的慢病毒载体pGIPZ-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒pGIPZ-miR-34a,与包装质粒Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒的包装,梯度稀释法检测重组慢病毒的滴度。将包装好的重组慢病毒感染SW480细胞,qPCR法检测感染细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平;MTT和平板克隆法检测感染细胞的增殖活力;流式细胞术检测感染细胞的细胞周期分布。结果 PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确;重组慢病毒的滴度为6.52×108TU/ml;重组慢病毒感染SW480细胞后,显著上调了细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平,明显抑制了细胞的增殖活力(P<0.01),G0-G1期细胞比例明显增加(P<0.01)。结论成功构建了miR-34a慢病毒表达质粒,慢病毒感染SW480细胞后,能显著提高miR-34a的内源性表达,并抑制细胞的增殖,为进一步研究miR-34a的功能及作用机制奠定了基础。
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