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【摘 要】随着分子生物技术的不断发展和创新，为污水处理处理系统中硝化菌群的研究提供了重要的依据，提高了污水处理系统运行稳定性。目前用于污水处理系统中硝化菌群分析的分子生物技术主要有FISH技术、PCR技术及SIP技术等。笔者结合自身实际工作经验，对这几种分析生物技术进行分析，希望对污水处理系统中的硝化菌群的研究，提供一定的参考价值。
【关键字】分子生物技术；污水处理系统；内硝化菌群；应用
1.前言
传统微生物技术由于过度依赖培养技术来分离菌种，导致污水处理系统在分析硝化菌群时存在很多的不足之处，主要表现在三个方面，其一，污水处理系统中的硝化菌群是由很多微生物组合而成的，并在一定空间内分布和聚集，导致微生物之间相互竞争和依存，使得菌种变得十分复杂。在菌种分离和培养时，无法获取自然状态下菌群的结构及其空间分布情况。其二，硝化菌群代谢活动及基因表达容易受到外部环境的影响，导致菌种在分离和培养时，使得微生物生化性质和物理性质发生改变。其三，菌种培养所学时间较长，现阶段一些菌种还未能进行纯培养。随着分子生物技术的推广和应用，有效保证了硝化菌群生物活性及分布稳定性，提高了污水处理系统效率和质量。
2.FISH分子生物技术
2.1FISH-microelectrodes技术
微电极技术可以对生物膜中的微小生境或者活性污泥所含絮体环境因素进行有效的检测和分析，清楚的反映出微生物菌群的代谢活性。FISH-microelectrodes技术主要是将微电极技术及FISH技术相结合，对微生物菌群代谢活性、空间分布及环境因素相联系，以获取相关的检测参数[1]。FISH-microelectrodes技术在硝化菌群研究中应用广泛，主要是能够明确生物膜垂直方向微生物菌群代谢活性和空间分布情况。
2.2Clone-FISH技术
Clone-FISH技术主要是通过FISH技术挑选出阳性性质的Clones或者观察探针有效性。这种检测技术在硝化菌群中的应用情况，主要体现在：其一，能够对硝化菌群探针有效性进行有效的检测。主要是用16S rRNA的克隆子来替换纯培养细胞，以检测出探针的有效性。其二，能够通过FISH技术在克隆文库筛选出呈阳性的克隆子，并对其基因片段转化成功情况进行有效的检验。
2.3FISH-MAR技术
有关研究表明，单一性的使用FISH技术，无法取得微生物菌群生理性质、代谢活性等信息，而单一性的使用MAR技术，同样不能获得微生物菌群分布情况及构成情况。Lee等研究者，将FISH技术和MAR技术相结合，成为FISH-MAR技术，其可以通过显微照片，清楚且直观的呈现出微生物菌群空间分布和结构组成情况，同时获取多种微生物菌群代谢活性。这种技术主要是将微生物菌群样本放到通过放射性的物质标识的无机或者有机底物中，对其进行培养，使得具有吸收性的放射底物内细胞，能够清楚呈现在显微图片中。
3.PCR分子生物技术
3.1PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术主要是将PCR的扩增产物放置到线性梯度的变性剂聚丙烯酰胺凝胶内，并进行电泳。虽然PCR扩增出DNA片段的长度均相同，但是其碱基序列去不相同。在电泳中，碱基序列不相同DNA片段将会在变性剂作用下发生变性，使得电泳速度快速降低，并留置在变性剂的梯度位置。然后经过相应的染色处理，在聚丙烯酰胺性凝胶上，会出现很多不同的DNA谱带，作为某个序列的一个DNA片段。为了防止异源双链核酸分子、探针特异性及单链DNA等检查结果受到影响，在经过PCR-DGGE检验后，需通过测序及克隆的方式来确认DNA的序列，获取硝化菌群的结构。Limpiyakorn、Ebie通过PCR-DGGE技术，分析不相同的污水处理系统中所含的硝化菌群，实验结果表明，污水处理系统中的AOB含量未变，但是在检测过程中容易受到温度计水质等因素的影响，使得污水处理系统中的AOB菌群的结构产生很大变化[2]。
3.2PCR-T-RFLP技术
PCR-T-RFLP技术主要是标记PCR扩增时引物端使用的荧光物质，在利用标记引物，对样品中的DNA实行PCR 扩增之后，PCR扩增所形成产物就会携带有荧光标记，可选择适宜的内切酶来消化PCR产物，即可形成长度不同的片段。与PCR-DGGE技术相比，PCR-T-RFLP技术能够在短时间范围内，对大量硝化菌群的结构进行有效的分析，同时具有灵敏度高、重现性好等优点。Egli等通过PCR-T-RFLP技术，对短程反应设备中的硝化菌群的结构进行有效检测和分析，检测结果表明，反应设备中的硝化菌群多样性正在慢慢下降，同时期在不同pH值和温度等条件下，其会呈现出不同的结构。Park等通过PCR-T-RFLP技术，分析了DO在活性污泥硝化菌群结构变化中的影响，同时对氧化沟中所含的硝化菌群的结构进行检测和分析，检测结果表明，在氧化沟缺氧及好氧相互交替的环境下，污水处理系统中所含的Nitrosospira-like量较大，并与SND现象相关。
3.3RT-PCR技术
RT-PCR技术主要是将RNA反转录技术与PCR扩增技术相结合。首先，模板RNA在反转录酶的作用，形成cDNA，然后再把cDNA作为相应模板，扩增并形成具有目的性的片段。模板RNA可以作为转录RNA或者总RNA的产物，并保证其所含的无RNA酶及DNA不受到任何污染。Terahara等通过RT-PCR技术，对污水处理系统中的硝化菌群所含的16S rRNA及16S rDNA进行检测和分析，检测结果表明，硝化菌群细胞中所含的16S rDNA增长速度低于16S rRNA，在外部环境影响下，硝化菌群细胞所含16S rRNA的多样性会发生变化。由于amoA基因是AMO活性的位点，通过单一性的PCR技术，并不能对amoA基因及硝化菌群活性进行有效的分析，同时amoA基因中的mRNA在硝化菌群中的更新速度较快，半衰期只有几分钟，因此利用RT-PCR技术对硝化菌群中amoA基因的mRNA进行有效的分析，可以验证外部环境对硝化菌群活性产生的影响，对于优化污水处理系统具有重要意义[3]。
4.SIP分子生物技术
SIP分子生物技术主要是通过稳定同位素在细胞上进行标记和分组，可以有效的识别生物代谢过程中存在的菌群，其实验安全性较高。核酸作为分子生物学用于分析微生物菌群的重要物质，因此可将其作为分析微生物菌群的标记物。研究者可依据稳定同位素中的原子密度来区分不同的核酸分子。首先，把微生物和标记底物相结合培养，使得微生物通过底物形成细胞组分。然后再提取细胞内的DNA分子，可知底物形成的DNA分子要比其余DNA分子要重，同时通过离心机来实现密度的梯度离心，可以有效的区分出不同密度的DNA分子，后可通过DNA分子性质或者定量来确定微生物的种类。这种分子生物技术在反硝化菌分析中的应用较为广泛。
【关键字】分子生物技术；污水处理系统；内硝化菌群；应用
1.前言
传统微生物技术由于过度依赖培养技术来分离菌种，导致污水处理系统在分析硝化菌群时存在很多的不足之处，主要表现在三个方面，其一，污水处理系统中的硝化菌群是由很多微生物组合而成的，并在一定空间内分布和聚集，导致微生物之间相互竞争和依存，使得菌种变得十分复杂。在菌种分离和培养时，无法获取自然状态下菌群的结构及其空间分布情况。其二，硝化菌群代谢活动及基因表达容易受到外部环境的影响，导致菌种在分离和培养时，使得微生物生化性质和物理性质发生改变。其三，菌种培养所学时间较长，现阶段一些菌种还未能进行纯培养。随着分子生物技术的推广和应用，有效保证了硝化菌群生物活性及分布稳定性，提高了污水处理系统效率和质量。
2.FISH分子生物技术
2.1FISH-microelectrodes技术
微电极技术可以对生物膜中的微小生境或者活性污泥所含絮体环境因素进行有效的检测和分析，清楚的反映出微生物菌群的代谢活性。FISH-microelectrodes技术主要是将微电极技术及FISH技术相结合，对微生物菌群代谢活性、空间分布及环境因素相联系，以获取相关的检测参数[1]。FISH-microelectrodes技术在硝化菌群研究中应用广泛，主要是能够明确生物膜垂直方向微生物菌群代谢活性和空间分布情况。
2.2Clone-FISH技术
Clone-FISH技术主要是通过FISH技术挑选出阳性性质的Clones或者观察探针有效性。这种检测技术在硝化菌群中的应用情况，主要体现在：其一，能够对硝化菌群探针有效性进行有效的检测。主要是用16S rRNA的克隆子来替换纯培养细胞，以检测出探针的有效性。其二，能够通过FISH技术在克隆文库筛选出呈阳性的克隆子，并对其基因片段转化成功情况进行有效的检验。
2.3FISH-MAR技术
有关研究表明，单一性的使用FISH技术，无法取得微生物菌群生理性质、代谢活性等信息，而单一性的使用MAR技术，同样不能获得微生物菌群分布情况及构成情况。Lee等研究者，将FISH技术和MAR技术相结合，成为FISH-MAR技术，其可以通过显微照片，清楚且直观的呈现出微生物菌群空间分布和结构组成情况，同时获取多种微生物菌群代谢活性。这种技术主要是将微生物菌群样本放到通过放射性的物质标识的无机或者有机底物中，对其进行培养，使得具有吸收性的放射底物内细胞，能够清楚呈现在显微图片中。
3.PCR分子生物技术
3.1PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术主要是将PCR的扩增产物放置到线性梯度的变性剂聚丙烯酰胺凝胶内，并进行电泳。虽然PCR扩增出DNA片段的长度均相同，但是其碱基序列去不相同。在电泳中，碱基序列不相同DNA片段将会在变性剂作用下发生变性，使得电泳速度快速降低，并留置在变性剂的梯度位置。然后经过相应的染色处理，在聚丙烯酰胺性凝胶上，会出现很多不同的DNA谱带，作为某个序列的一个DNA片段。为了防止异源双链核酸分子、探针特异性及单链DNA等检查结果受到影响，在经过PCR-DGGE检验后，需通过测序及克隆的方式来确认DNA的序列，获取硝化菌群的结构。Limpiyakorn、Ebie通过PCR-DGGE技术，分析不相同的污水处理系统中所含的硝化菌群，实验结果表明，污水处理系统中的AOB含量未变，但是在检测过程中容易受到温度计水质等因素的影响，使得污水处理系统中的AOB菌群的结构产生很大变化[2]。
3.2PCR-T-RFLP技术
PCR-T-RFLP技术主要是标记PCR扩增时引物端使用的荧光物质，在利用标记引物，对样品中的DNA实行PCR 扩增之后，PCR扩增所形成产物就会携带有荧光标记，可选择适宜的内切酶来消化PCR产物，即可形成长度不同的片段。与PCR-DGGE技术相比，PCR-T-RFLP技术能够在短时间范围内，对大量硝化菌群的结构进行有效的分析，同时具有灵敏度高、重现性好等优点。Egli等通过PCR-T-RFLP技术，对短程反应设备中的硝化菌群的结构进行有效检测和分析，检测结果表明，反应设备中的硝化菌群多样性正在慢慢下降，同时期在不同pH值和温度等条件下，其会呈现出不同的结构。Park等通过PCR-T-RFLP技术，分析了DO在活性污泥硝化菌群结构变化中的影响，同时对氧化沟中所含的硝化菌群的结构进行检测和分析，检测结果表明，在氧化沟缺氧及好氧相互交替的环境下，污水处理系统中所含的Nitrosospira-like量较大，并与SND现象相关。
3.3RT-PCR技术
RT-PCR技术主要是将RNA反转录技术与PCR扩增技术相结合。首先，模板RNA在反转录酶的作用，形成cDNA，然后再把cDNA作为相应模板，扩增并形成具有目的性的片段。模板RNA可以作为转录RNA或者总RNA的产物，并保证其所含的无RNA酶及DNA不受到任何污染。Terahara等通过RT-PCR技术，对污水处理系统中的硝化菌群所含的16S rRNA及16S rDNA进行检测和分析，检测结果表明，硝化菌群细胞中所含的16S rDNA增长速度低于16S rRNA，在外部环境影响下，硝化菌群细胞所含16S rRNA的多样性会发生变化。由于amoA基因是AMO活性的位点，通过单一性的PCR技术，并不能对amoA基因及硝化菌群活性进行有效的分析，同时amoA基因中的mRNA在硝化菌群中的更新速度较快，半衰期只有几分钟，因此利用RT-PCR技术对硝化菌群中amoA基因的mRNA进行有效的分析，可以验证外部环境对硝化菌群活性产生的影响，对于优化污水处理系统具有重要意义[3]。
4.SIP分子生物技术
SIP分子生物技术主要是通过稳定同位素在细胞上进行标记和分组，可以有效的识别生物代谢过程中存在的菌群，其实验安全性较高。核酸作为分子生物学用于分析微生物菌群的重要物质，因此可将其作为分析微生物菌群的标记物。研究者可依据稳定同位素中的原子密度来区分不同的核酸分子。首先，把微生物和标记底物相结合培养，使得微生物通过底物形成细胞组分。然后再提取细胞内的DNA分子，可知底物形成的DNA分子要比其余DNA分子要重，同时通过离心机来实现密度的梯度离心，可以有效的区分出不同密度的DNA分子，后可通过DNA分子性质或者定量来确定微生物的种类。这种分子生物技术在反硝化菌分析中的应用较为广泛。