【摘 要】
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目的 应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAv-AsiNOS).方法 应用RT-PCR技术扩增iNOS目的 基因片断,EcoRI和Xba I内切酶分别双
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目的 应用分子克隆技术构建携带诱导型一氧化氮合酶(iNOS)反义基因片断的重组腺病毒载体(rAAv-AsiNOS).方法 应用RT-PCR技术扩增iNOS目的 基因片断,EcoRI和Xba I内切酶分别双酶切pAAv-MCS质粒和iNOS基因,经过胶回收和纯化后,住T4连接酶作用下,构建rAAV-AsiNOS重组质粒,并转化到感受态细菌XL-10中,进行鉴定和测序,293细胞病毒包装,重组腺相关病毒载体大量扩增,滴度和感染率的测定以及浓缩和纯化.结果 从SD大鼠脑缺血区域中扩增的iNOS特异性片段大小分别为361bp;经双酶切和连接成重组质粒rAAv-AsiNOS;PCR鉴定结果显示重组质粒rAAV-AsnNOS目的 基因产物特异性片段大小为593bp;基因测序结果显示iNOS基因片段分别反向克隆到pAAV的MCS,成功地构建携带反义iNOS基因的重组质粒rAAv-AsiNOS;经测算病毒原液的滴度为(6～12)×107个/ml,对PCI2细胞的感染率约为70%;分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体,获得较高的病毒滴度,均约2×1010个病毒颗粒/ml,去除腺病毒等影响因素.结论 成功构建携带iNOS反义基因的腺相关病毒载体,测序证实iNOS基因片断分别反向克隆到的腺相关病毒载体上;证实重组腺相关载体能够传染PCI2细胞,转染率为70%.
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