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摘要：从木论喀斯特森林保护区土壤中分离获得1株对家蚕败血病病原具有显著拮抗作用的菌株，并研究其对家蚕败血病的抑菌效果，以期为新型微生物农药的开发奠定基础。拮抗菌株的发酵产物对败血菌具有较强的拮抗作用，抑菌圈直径平均为22.60 mm，抗菌发酵液最大稀释倍数可达60倍。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析对其鉴定为Paenibacillus polymyxa，命名为Paenibacillus polymyxa HC2015。
关键词：家蚕；败血病；拮抗菌；抑菌作用
中图分类号： S884.4 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0328-02
细菌、真菌、病毒分别为家蚕疾病的三大病原。家蚕败血病（Bacterial septicemia）是很严重的细菌病害，目前主要以化学药品防治败血病。大量使用化学药品易导致环境污染并威胁人体健康，因此采用生物制品取代化学药品是大势所趋。筛选家蚕病原物拮抗菌对生态蚕业的发展具有重要意义。
目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸出，学者从土壤、水、植物体内筛选分离拮抗菌菌株，并证实其在生物防治、促进生物健康发育等多个方面具有利用价值[1-3]。然而，生物防治主要应用于植物病害，关于动物病害防治的研究鲜见报道。笔者所在课题组从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选出1株对家蚕败血病病原具有显著拮抗作用的菌株，且其抑菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、家蚕病原菌败血菌、苏云金芽孢杆菌、黑霉菌、大肠杆菌等多种动植物病原菌均有较强的拮抗作用。本试验检测了A-02菌株对家蚕败血病的拮抗作用，以期为新型蚕桑用微生物农药的开发提供依据。
1材料与方法
1.1材料
家蚕败血菌（Bacterial septicemia）由笔者所在实验室保存，家蚕败血病菌病原拮抗菌菌株从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选获得。
1.2菌悬液制备及分离培养
称取土壤10 g，于灭菌研钵中研碎，将100 mL无菌水加入灭菌研钵，振荡10～20 min，即为10-1的土壤悬液；静置 5～10 min，吸取上清液1 mL，依次梯度稀释，分别配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同浓度的稀释液。取0.1 mL悬液均匀涂布于培养皿中，待表面干燥后，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养4～5 d，根据菌落的大小、形状、边缘形状、表面结构、光泽、透明度、颜色等微生物菌落特征挑出单菌落并编号。
1.3拮抗性能的检测
采用平板对峙法检测菌株拮抗，设置3个重复，于28 ℃下培养45 d。依据病原菌与拮抗菌之间的距离判断拮抗作用大小，保留拮抗效果优良的菌株。
采用平板扩散法检测发酵液活性，利用PDA 液体培养基，于28 ℃下培养16～24 h，记录发酵液扩散形成抑菌圈的最大稀释倍数。筛选拮抗效果和发酵性能优良的菌株。
1.4菌体形态特征及生理生化指标的测定
菌体形态及最适pH值测定、过氧化氢酶试验、甲基红试验、氧化酶试验、脲酶试验、吲哚试验测试、淀粉水解、V. P试验及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇发酵试验均参照相关文献中的方法[4]进行。
1.516S rDNA序列测定及其系统进化树的构建
16S rDNA序列PCR测定以通用的27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′为引物，以提取的总DNA为模板。PCR技术扩增16S rDNA序列的反应程序为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增出16S rDNA后，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，经DNA胶回收试剂盒纯化后，直接邮寄至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析，并筛选出9株菌株16S rDNA的全序列，采用ClustalW软件构建系统进化树。
2结果与分析
2.1菌株的分离筛选
经拮抗性能检测筛选到1 株对家蚕病原菌（金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌）均有较强拮抗作用的菌株，编号为 A-02。该菌株对败血病菌的抑制效果较强，抑菌圈直径平均为22.60 mm，抗菌发酵液最大稀释倍数可达到60倍（图1）。由表1可知，A-02菌株及其发酵液对败血病菌、苏云金杆菌的拮抗作用最强，对金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌也有一定拮抗作用；发酵液稀释40～60倍时，对上述病原菌的拮抗作用仍明显，可见该菌株的发酵性能良好。
2.2拮抗菌培养形态特征及革兰氏染色结果
A-02菌株在PDA培养平板上生长的菌落特征为乳白色菌落、有光泽、菌落光滑、半透明。A-02菌株革兰氏染色为阳性；芽孢为椭圆型，菌体形态为杆状，芽孢、细胞壁革兰氏染色均为阳性。
2.3生理生化特征
A-02菌株为好氧菌，可于厌氧条件下生长。菌体受pH值影响不大，在pH值5～9区间培养抑菌效果良好（图2）。不能利用天门冬素培养基作为氮源，可利用无机氮源。A-02 菌株过氧化氢酶试验有气泡产生，为阳性；甲基红试验为黄色，呈阴性反应；氧化酶试验为阳性；脲酶试验为阴性反应；吲哚试验为阴性反应；葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇发酵试验反应为阳性；水解淀粉试验为阳性反应，表明该菌株可分解淀粉；该菌株可使明胶液化；V. P试验呈红色，为阳性反应。
2.4系统进化树的构建与分析
将测序所得A-02菌株的16S rDNA碱基序列于NCBI数据库BLAST上进行比对，选取9株同源性高的菌株构建系统进化树（图3）。A-02菌株以100%的同源性属于Paenibacillus polymyxa。 根据形态特征和生理生化指标，鉴定该菌株属于多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），依据系统命名法将其命名为Paenibacillus polymyxa HC2015。
3讨论
化学药物的过量使用使病原病害产生恶性抗药性，破坏生态环境，研发高效、安全的生物药物是大势所趋[5-6]。生物药物的广泛利用须满足遗传稳定性、抗逆性2个必备条件，而A-02 菌株的遗传稳定性与抗逆性满足生物药物的要求。通过16S rDNA的序列同源性、菌株形态特征、生理生化指标鉴定该菌株为多黏类芽孢杆菌。由于A-02菌株高产抗菌活性物质，是一种较好的拮抗菌，对动植物病原菌具有较强的抑制活性，起到抗病作用。本研究对于探索家蚕病原物的生物防治方法以及蚕业发展具有重要意义。
参考文献：
[1]查传勇，董法宝，杨悦，等. 洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化[J]. 蚕业科学，2009，35（2）：229-235.
[2]Agodi A，Mahenthiralingam E，Barchitta M，et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis：Prevalence，epidemiology，and genomovar status[J]. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（8）：2891-2896.
[3]Parke J L，Gurian S D. Diversity of the burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains[J]. Annual Review of Phytopathology，2001，39：225-258.
[4]布坎南 R E，吉本斯N E. 伯杰氏细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京：科学出版社，1984.
[5]张爱华，任志成，王壮，等. 不同生物源农药对西洋参主要病害的室内抑菌活性及田间防效[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：197-200.
[6]马丽，王开梅，李维林，等. 蒺藜提取物作为生物农药的效果[J]. 江苏农业科学，2014，42（3）：86-87.唐瞻杨，蒋毅，周宇，等. 三元杂交尼奥罗非鱼组合的初步研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：330-332.
关键词：家蚕；败血病；拮抗菌；抑菌作用
中图分类号： S884.4 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0328-02
细菌、真菌、病毒分别为家蚕疾病的三大病原。家蚕败血病（Bacterial septicemia）是很严重的细菌病害，目前主要以化学药品防治败血病。大量使用化学药品易导致环境污染并威胁人体健康，因此采用生物制品取代化学药品是大势所趋。筛选家蚕病原物拮抗菌对生态蚕业的发展具有重要意义。
目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸出，学者从土壤、水、植物体内筛选分离拮抗菌菌株，并证实其在生物防治、促进生物健康发育等多个方面具有利用价值[1-3]。然而，生物防治主要应用于植物病害，关于动物病害防治的研究鲜见报道。笔者所在课题组从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选出1株对家蚕败血病病原具有显著拮抗作用的菌株，且其抑菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、家蚕病原菌败血菌、苏云金芽孢杆菌、黑霉菌、大肠杆菌等多种动植物病原菌均有较强的拮抗作用。本试验检测了A-02菌株对家蚕败血病的拮抗作用，以期为新型蚕桑用微生物农药的开发提供依据。
1材料与方法
1.1材料
家蚕败血菌（Bacterial septicemia）由笔者所在实验室保存，家蚕败血病菌病原拮抗菌菌株从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选获得。
1.2菌悬液制备及分离培养
称取土壤10 g，于灭菌研钵中研碎，将100 mL无菌水加入灭菌研钵，振荡10～20 min，即为10-1的土壤悬液；静置 5～10 min，吸取上清液1 mL，依次梯度稀释，分别配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同浓度的稀释液。取0.1 mL悬液均匀涂布于培养皿中，待表面干燥后，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养4～5 d，根据菌落的大小、形状、边缘形状、表面结构、光泽、透明度、颜色等微生物菌落特征挑出单菌落并编号。
1.3拮抗性能的检测
采用平板对峙法检测菌株拮抗，设置3个重复，于28 ℃下培养45 d。依据病原菌与拮抗菌之间的距离判断拮抗作用大小，保留拮抗效果优良的菌株。
采用平板扩散法检测发酵液活性，利用PDA 液体培养基，于28 ℃下培养16～24 h，记录发酵液扩散形成抑菌圈的最大稀释倍数。筛选拮抗效果和发酵性能优良的菌株。
1.4菌体形态特征及生理生化指标的测定
菌体形态及最适pH值测定、过氧化氢酶试验、甲基红试验、氧化酶试验、脲酶试验、吲哚试验测试、淀粉水解、V. P试验及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇发酵试验均参照相关文献中的方法[4]进行。
1.516S rDNA序列测定及其系统进化树的构建
16S rDNA序列PCR测定以通用的27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′为引物，以提取的总DNA为模板。PCR技术扩增16S rDNA序列的反应程序为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增出16S rDNA后，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，经DNA胶回收试剂盒纯化后，直接邮寄至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析，并筛选出9株菌株16S rDNA的全序列，采用ClustalW软件构建系统进化树。
2结果与分析
2.1菌株的分离筛选
经拮抗性能检测筛选到1 株对家蚕病原菌（金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌）均有较强拮抗作用的菌株，编号为 A-02。该菌株对败血病菌的抑制效果较强，抑菌圈直径平均为22.60 mm，抗菌发酵液最大稀释倍数可达到60倍（图1）。由表1可知，A-02菌株及其发酵液对败血病菌、苏云金杆菌的拮抗作用最强，对金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌也有一定拮抗作用；发酵液稀释40～60倍时，对上述病原菌的拮抗作用仍明显，可见该菌株的发酵性能良好。
2.2拮抗菌培养形态特征及革兰氏染色结果
A-02菌株在PDA培养平板上生长的菌落特征为乳白色菌落、有光泽、菌落光滑、半透明。A-02菌株革兰氏染色为阳性；芽孢为椭圆型，菌体形态为杆状，芽孢、细胞壁革兰氏染色均为阳性。
2.3生理生化特征
A-02菌株为好氧菌，可于厌氧条件下生长。菌体受pH值影响不大，在pH值5～9区间培养抑菌效果良好（图2）。不能利用天门冬素培养基作为氮源，可利用无机氮源。A-02 菌株过氧化氢酶试验有气泡产生，为阳性；甲基红试验为黄色，呈阴性反应；氧化酶试验为阳性；脲酶试验为阴性反应；吲哚试验为阴性反应；葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、甘露醇发酵试验反应为阳性；水解淀粉试验为阳性反应，表明该菌株可分解淀粉；该菌株可使明胶液化；V. P试验呈红色，为阳性反应。
2.4系统进化树的构建与分析
将测序所得A-02菌株的16S rDNA碱基序列于NCBI数据库BLAST上进行比对，选取9株同源性高的菌株构建系统进化树（图3）。A-02菌株以100%的同源性属于Paenibacillus polymyxa。 根据形态特征和生理生化指标，鉴定该菌株属于多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），依据系统命名法将其命名为Paenibacillus polymyxa HC2015。
3讨论
化学药物的过量使用使病原病害产生恶性抗药性，破坏生态环境，研发高效、安全的生物药物是大势所趋[5-6]。生物药物的广泛利用须满足遗传稳定性、抗逆性2个必备条件，而A-02 菌株的遗传稳定性与抗逆性满足生物药物的要求。通过16S rDNA的序列同源性、菌株形态特征、生理生化指标鉴定该菌株为多黏类芽孢杆菌。由于A-02菌株高产抗菌活性物质，是一种较好的拮抗菌，对动植物病原菌具有较强的抑制活性，起到抗病作用。本研究对于探索家蚕病原物的生物防治方法以及蚕业发展具有重要意义。
参考文献：
[1]查传勇，董法宝，杨悦，等. 洋葱伯克霍尔德氏菌Lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化[J]. 蚕业科学，2009，35（2）：229-235.
[2]Agodi A，Mahenthiralingam E，Barchitta M，et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis：Prevalence，epidemiology，and genomovar status[J]. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（8）：2891-2896.
[3]Parke J L，Gurian S D. Diversity of the burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains[J]. Annual Review of Phytopathology，2001，39：225-258.
[4]布坎南 R E，吉本斯N E. 伯杰氏细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京：科学出版社，1984.
[5]张爱华，任志成，王壮，等. 不同生物源农药对西洋参主要病害的室内抑菌活性及田间防效[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：197-200.
[6]马丽，王开梅，李维林，等. 蒺藜提取物作为生物农药的效果[J]. 江苏农业科学，2014，42（3）：86-87.唐瞻杨，蒋毅，周宇，等. 三元杂交尼奥罗非鱼组合的初步研究[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：330-332.