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摘要：【目的】分析草菇钙调磷酸酶催化亚基（Vv-CNA）的序列与表达，为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考。【方法】通过生物信息学分析确定Vv-CNA基因的组成及保守结构，将ORF Finder预测的草菇CNA氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列进行比对，并通过荧光定量PCR检测Vv-CNA基因在草菇不同生长时期的相对表达量。【结果】Vv-CNA基因编码区为2503 bp，包含10个内含子（其中I2、I8、I9和I10存在内含子保留现象），编码610个氨基酸，GenBank登录号KX463514。將Vv-CNA氨基酸序列与动物（人、小鼠）、植物（拟南芥、水稻）和真菌（曲霉、酵母等）的CNA氨基酸序列进行同源比对分析，结果发现Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域，与密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）的亲缘关系最近。Vv-CNA基因在草菇子实体的蛋形期和伸长期高表达，以蛋形期的相对表达量最高。【结论】Vv-CNA基因编码钙调磷酸酶催化亚基，其高表达有利于草菇菌柄的伸长。
关键词： 草菇；钙调磷酸酶催化亚基（CNA）；基因结构；表达分析；菌柄伸长
中图分类号： S646.13 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0381-05
0 引言
【研究意义】草菇（Volvariella volvacea）质嫩味鲜，是我国主栽食用菌之一，在我国南方地区广泛种植。草菇属于高温型食用菌，生长速度快，栽培周期短，播种后一周左右出菇、10 d左右采收。草菇子实体在蛋形期细胞大量增殖与伸长，3～4 h就能使外菌膜破裂而开伞，丧失商品价值（刘学铭等，2011）。分析草菇菌柄伸长（蛋形期和伸长期）特异表达的基因，研究其结构和功能，揭示菌柄伸长的分子机理，对控制草菇开伞具有重要的理论与实践意义。钙调磷酸酶（Calcineurin，CN）是受Ca2+/钙调素（Calmodulin，CaM）直接调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，为异源二聚体结构，其组成元件有催化亚基（CNA）和调节亚基（CNB）。CN的催化亚基A（CNA）主要由N-端区域、催化结构域、B亚基结合结构域、钙调素结合结构域和自抑制区五部分组成，调节亚基B（CNB）是Ca2+结合蛋白EF-hand家族成员之一，B亚基分子上有4个Ca2+结合位点。A亚基与B亚基相结合，才能使CN发挥对生物生长发育的重要调控作用（Herzig and Neumann，2000；Rusnak and Mertz，2000；Ke and Huai，2003）。【前人研究进展】目前关于CN的研究在动物、植物和真菌中均有报道。Molkentin等（1998）发现，在小鼠肥大的心脏肌肉组织中，CN活性及去磷酸化的NFAT（Nuclear factor of activated T cells）含量均大幅度增加，用CN抑制剂处理CN转基因小鼠，小鼠的平均心脏重量明显减小，心脏发育趋向正常水平；Parsons等（2004）研究发现，当CNA发生变异时，大鼠慢缩型纤维组织比例明显下降，用环孢素A抑制CN活性，大鼠骨骼肌出现由慢缩纤维向快缩纤维转化。Gu等（2008）在研究水稻抗逆性过程中发现，CBL8（Calcineurin B-like protein 8）的上调表达可提高水稻在高盐环境下的耐受性；Cheong等（2010）的研究结果表明，CBL5（Calcineurin B-like protein 5）在拟南芥中的过量表达可增强其对高盐和干旱胁迫的耐受性。在真菌方面，Steinbach等（2006）在缺失CNA的烟曲霉突变菌株中发现其菌丝生长量明显减少，孢子的形成也受到严重影响；张世伟（2014）研究表明，在破坏CNA结构的球孢白僵菌中，其细胞壁厚度减小、细胞壁成分发生变化，从而导致细胞壁完整性受到影响。【本研究切入点】现有关于CN的研究主要在动物、植物和真菌上，在食用菌中的研究较少，在草菇上未见相关研究报道。福建农林大学菌物研究中心已完成了草菇基因组和不同生长发育时期表达谱的测序工作，以此为切入点，分析与草菇菌柄生长相关的基因。【拟解决的关键问题】通过对草菇基因组和表达谱数据进行分析，找到一个CNA编码基因，运用相关生物信息学方法确定该基因编码蛋白的性质与功能，及其在草菇不同生长时期的表达规律，旨在为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验草菇菌株H1521由福建主栽品种屏优一号（PY）分离的2个单孢菌株PYd15和PYd21配对杂交获得。PYd15、PYd21和H1521均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心保藏。
1. 2 基因结构分析
将从Scaffold上预测获得的基因序列向前、后各延伸3 kb，使用这一序列作为初始参考序列，在Zoom Lite 1.5.4上对转录组测序片段进行定位（Morrissy et al.，2009），找到转录起始、终止位点和内含子位点及其可变剪接的位置。采用ORF Finder对截获的cDNA序列进行开放阅读框区域预测，获得其编码的完整氨基酸序列。将获得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLASTp分析，进一步验证基因同源性（刘朋虎等，2013）。
1. 3 蛋白保守结构域分析
分别从NCBI、UniProt（http：//www.uniprot.org/）数据库中下载其他物种的CNA氨基酸序列，运用ClustalX进行同源比对分析，预测Vv-CNA的保守结构域。
1. 4 序列比对和系统进化分析
将开放阅读框读取的氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列运用MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的Muscle法进行序列比对，并采用最大似然法进行系统发育进化树构建，Bootstrap自检值设为1000。 1. 5 基因表达量检测
采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司），分别提取草菇钮扣期、蛋形期、伸长期和成熟期的菌柄样品总RNA，采用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One Step gDNA Removal）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）反转录得到不同时期的cDNA样品，作为荧光定量PCR的模板。具体程序和步骤参照试剂盒说明书。
根据Zoom定位的内含子位点，用Primer Premier 5.0设计引物，采用草菇甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.4 μL，模板（cDNA）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，总体积20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。
1. 6 统计分析
采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），每个样本重复3次。运用SPSS Statistics.19中的单因素ANOVA分析，进行LSD方差齐性检验，对数据进行显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 基因结构分析结果
通过Zoom Lite 1.5.4进行转录组定位，结果显示，Vv-CNA基因编码区长度为2503 bp，序列共包含10个内含子，其中4个内含子（I2、I8、I9、I10）存在保留现象（图1）。通过ORF Finder对Vv-CNA基因的cDNA序列进行阅读搜索，得到一个长度为1833 bp的完整阅读框，该阅读框编码610个氨基酸。该基因已上传至NCBI，GenBank登录号为KX463514。
2. 2 蛋白保守结构域分析结果
将Vv-CNA氨基酸序列与动物（人、小鼠）、植物（拟南芥、水稻）及真菌（曲霉、酵母等）中的CNA氨基酸序列进行同源比对，结果（图2）表明，Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域，分别为GD（I/V）HG、GDYVDR和GNHE。其中，D、H和N为金属离子结合位点（用三角号标出），DR和H为活性部位中非常保守的位点（用下划线标出）（张志新等，2008）。这些保守结构域的存在进一步验证了Vv-CNA蛋白为钙调磷酸酶催化亚基的推定。
2. 3 系统进化分析结果
将ORF Finder预測的Vv-CNA氨基酸序列与其他一些真菌CNA氨基酸序列通过序列比对，并构建系统发育进化树。由图3可知，Vv-CNA编码蛋白与毛韧革菌（Stereum hirsutum）、云芝（Trametes versicolor）及密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）等担子菌属蛋白聚在同一进化支上，其中与密褐褶菌的亲缘关系最近。这些进化树数据均支持蛋白Vv-CNA为草菇中钙调磷酸酶催化亚基的推定。
2. 4 Vv-CNA基因在草菇菌柄伸长过程中的差异表达分析结果
针对Vv-CNA基因序列设计引物并进行荧光定量PCR检测，图4显示，与钮扣期相比，Vv-CNA基因的相对表达量在草菇生长的蛋形期和伸长期呈显著上调表达（P<0.05），成熟期呈下调表达。由此可推测，CN在草菇菌柄伸长生长过程中发挥一定的作用。
3 讨论
CN是参与代谢调控的重要因子，其酶活功能主要由A亚基体现，B亚基起调节作用，B亚基与A亚基紧密地结合时，CN才能发挥其功能（Ke and Huai，2003）。相关研究表明，Ca2+和钙调蛋白共同调节CN活性，参与细胞活化、增殖、凋亡及对逆境等多种生命活动的调控（Klee et al.，1998；Zhao et al.，1998；Batistic and Kudla，2004；Steinbach et al.，2006）。
本研究首次从草菇基因组中获得一个钙调磷酸酶催化亚基编码基因（Vv-CNA），经相关生物信息学分析，发现Vv-CNA开放阅读框长度1833 bp，含有4个内含子保留位点，编码610个氨基酸，CNA蛋白具备CNA最保守的结构域，但与其他物种尚存在一定差异。通过系统进化分析，发现Vv-CNA与密褐褶菌（G. trabeum）相似性最高，通过荧光定量PCR检测发现Vv-CNA基因在草菇蛋形期和伸长期菌柄呈上调表达，由此可推测该基因与草菇菌柄伸长有关。
张世伟（2014）研究发现，当破坏CNA时，细胞壁变薄，且细胞壁中多糖含量上升，几丁质含量明显下降，对细胞壁合成抑制剂刚果红的敏感性明显增强。由此表明，CN影响细胞壁的合成及其结构完整性。草菇等大型担子菌菌柄的伸长主要取决于细胞的伸长生长，而细胞的伸长主要由细胞壁的延伸所引起（Kües and Navarro-González，2015）。由此推测，Vv-CNA基因在蛋形期和伸长期菌柄中的上调表达可提高细胞壁的合成能力，从而促进菌柄细胞的伸长。由Ca2+参与的钙调信号转导途径是真核生物中影响生长过程的重要通路。CN调节途径是调节Ca2+浓度的关键途径，草菇中CN的发现有利于进一步探究其Ca2+信号转导途径的作用机制，但要获得CN在草菇钙离子信号通路中的具体作用机制还需进一步研究。
4 结论
Vv-CNA基因在草菇生长的蛋形期和伸长期表达量显著上调，推测该基因高表达有利于草菇菌柄的伸长。
参考文献：
刘朋虎，谢宝贵，邓优锦，江玉姬. 2013. 草菇磷酸果糖激酶（PFK）基因克隆、结构及不同菌株中表达量分析[J]. 菌物学报，32（2）：253-260. Liu P H，Xie B G，Deng Y J，Jiang Y J. 2013. Cloning，structural analyses and expression levels of phosphofructokinase gene in different strains of Volvariella volvacea[J]. Mycosystema，32（2）：253-260.
劉学铭，廖森泰，陈智毅. 2011. 草菇的化学特性与药理作用及保鲜与加工研究进展[J]. 食品科学，32（1）：260-264.
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（責任编辑 罗 丽）
关键词： 草菇；钙调磷酸酶催化亚基（CNA）；基因结构；表达分析；菌柄伸长
中图分类号： S646.13 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0381-05
0 引言
【研究意义】草菇（Volvariella volvacea）质嫩味鲜，是我国主栽食用菌之一，在我国南方地区广泛种植。草菇属于高温型食用菌，生长速度快，栽培周期短，播种后一周左右出菇、10 d左右采收。草菇子实体在蛋形期细胞大量增殖与伸长，3～4 h就能使外菌膜破裂而开伞，丧失商品价值（刘学铭等，2011）。分析草菇菌柄伸长（蛋形期和伸长期）特异表达的基因，研究其结构和功能，揭示菌柄伸长的分子机理，对控制草菇开伞具有重要的理论与实践意义。钙调磷酸酶（Calcineurin，CN）是受Ca2+/钙调素（Calmodulin，CaM）直接调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，为异源二聚体结构，其组成元件有催化亚基（CNA）和调节亚基（CNB）。CN的催化亚基A（CNA）主要由N-端区域、催化结构域、B亚基结合结构域、钙调素结合结构域和自抑制区五部分组成，调节亚基B（CNB）是Ca2+结合蛋白EF-hand家族成员之一，B亚基分子上有4个Ca2+结合位点。A亚基与B亚基相结合，才能使CN发挥对生物生长发育的重要调控作用（Herzig and Neumann，2000；Rusnak and Mertz，2000；Ke and Huai，2003）。【前人研究进展】目前关于CN的研究在动物、植物和真菌中均有报道。Molkentin等（1998）发现，在小鼠肥大的心脏肌肉组织中，CN活性及去磷酸化的NFAT（Nuclear factor of activated T cells）含量均大幅度增加，用CN抑制剂处理CN转基因小鼠，小鼠的平均心脏重量明显减小，心脏发育趋向正常水平；Parsons等（2004）研究发现，当CNA发生变异时，大鼠慢缩型纤维组织比例明显下降，用环孢素A抑制CN活性，大鼠骨骼肌出现由慢缩纤维向快缩纤维转化。Gu等（2008）在研究水稻抗逆性过程中发现，CBL8（Calcineurin B-like protein 8）的上调表达可提高水稻在高盐环境下的耐受性；Cheong等（2010）的研究结果表明，CBL5（Calcineurin B-like protein 5）在拟南芥中的过量表达可增强其对高盐和干旱胁迫的耐受性。在真菌方面，Steinbach等（2006）在缺失CNA的烟曲霉突变菌株中发现其菌丝生长量明显减少，孢子的形成也受到严重影响；张世伟（2014）研究表明，在破坏CNA结构的球孢白僵菌中，其细胞壁厚度减小、细胞壁成分发生变化，从而导致细胞壁完整性受到影响。【本研究切入点】现有关于CN的研究主要在动物、植物和真菌上，在食用菌中的研究较少，在草菇上未见相关研究报道。福建农林大学菌物研究中心已完成了草菇基因组和不同生长发育时期表达谱的测序工作，以此为切入点，分析与草菇菌柄生长相关的基因。【拟解决的关键问题】通过对草菇基因组和表达谱数据进行分析，找到一个CNA编码基因，运用相关生物信息学方法确定该基因编码蛋白的性质与功能，及其在草菇不同生长时期的表达规律，旨在为进一步探究草菇生长发育及子实体开伞分子调控机理提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验草菇菌株H1521由福建主栽品种屏优一号（PY）分离的2个单孢菌株PYd15和PYd21配对杂交获得。PYd15、PYd21和H1521均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心保藏。
1. 2 基因结构分析
将从Scaffold上预测获得的基因序列向前、后各延伸3 kb，使用这一序列作为初始参考序列，在Zoom Lite 1.5.4上对转录组测序片段进行定位（Morrissy et al.，2009），找到转录起始、终止位点和内含子位点及其可变剪接的位置。采用ORF Finder对截获的cDNA序列进行开放阅读框区域预测，获得其编码的完整氨基酸序列。将获得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLASTp分析，进一步验证基因同源性（刘朋虎等，2013）。
1. 3 蛋白保守结构域分析
分别从NCBI、UniProt（http：//www.uniprot.org/）数据库中下载其他物种的CNA氨基酸序列，运用ClustalX进行同源比对分析，预测Vv-CNA的保守结构域。
1. 4 序列比对和系统进化分析
将开放阅读框读取的氨基酸序列与从NCBI下载的其他真菌CNA氨基酸序列运用MEGA 5.0（Tamura et al.，2011）的Muscle法进行序列比对，并采用最大似然法进行系统发育进化树构建，Bootstrap自检值设为1000。 1. 5 基因表达量检测
采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司），分别提取草菇钮扣期、蛋形期、伸长期和成熟期的菌柄样品总RNA，采用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One Step gDNA Removal）试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）反转录得到不同时期的cDNA样品，作为荧光定量PCR的模板。具体程序和步骤参照试剂盒说明书。
根据Zoom定位的内含子位点，用Primer Premier 5.0设计引物，采用草菇甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，上、下游引物（0.4 μmol/L）各0.4 μL，模板（cDNA）2.0 μL，ddH2O 7.2 μL，总体积20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。
1. 6 统计分析
采用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），每个样本重复3次。运用SPSS Statistics.19中的单因素ANOVA分析，进行LSD方差齐性检验，对数据进行显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 基因结构分析结果
通过Zoom Lite 1.5.4进行转录组定位，结果显示，Vv-CNA基因编码区长度为2503 bp，序列共包含10个内含子，其中4个内含子（I2、I8、I9、I10）存在保留现象（图1）。通过ORF Finder对Vv-CNA基因的cDNA序列进行阅读搜索，得到一个长度为1833 bp的完整阅读框，该阅读框编码610个氨基酸。该基因已上传至NCBI，GenBank登录号为KX463514。
2. 2 蛋白保守结构域分析结果
将Vv-CNA氨基酸序列与动物（人、小鼠）、植物（拟南芥、水稻）及真菌（曲霉、酵母等）中的CNA氨基酸序列进行同源比对，结果（图2）表明，Vv-CNA蛋白有3个最保守的结构域，分别为GD（I/V）HG、GDYVDR和GNHE。其中，D、H和N为金属离子结合位点（用三角号标出），DR和H为活性部位中非常保守的位点（用下划线标出）（张志新等，2008）。这些保守结构域的存在进一步验证了Vv-CNA蛋白为钙调磷酸酶催化亚基的推定。
2. 3 系统进化分析结果
将ORF Finder预測的Vv-CNA氨基酸序列与其他一些真菌CNA氨基酸序列通过序列比对，并构建系统发育进化树。由图3可知，Vv-CNA编码蛋白与毛韧革菌（Stereum hirsutum）、云芝（Trametes versicolor）及密褐褶菌（Gloeophyllum trabeum）等担子菌属蛋白聚在同一进化支上，其中与密褐褶菌的亲缘关系最近。这些进化树数据均支持蛋白Vv-CNA为草菇中钙调磷酸酶催化亚基的推定。
2. 4 Vv-CNA基因在草菇菌柄伸长过程中的差异表达分析结果
针对Vv-CNA基因序列设计引物并进行荧光定量PCR检测，图4显示，与钮扣期相比，Vv-CNA基因的相对表达量在草菇生长的蛋形期和伸长期呈显著上调表达（P<0.05），成熟期呈下调表达。由此可推测，CN在草菇菌柄伸长生长过程中发挥一定的作用。
3 讨论
CN是参与代谢调控的重要因子，其酶活功能主要由A亚基体现，B亚基起调节作用，B亚基与A亚基紧密地结合时，CN才能发挥其功能（Ke and Huai，2003）。相关研究表明，Ca2+和钙调蛋白共同调节CN活性，参与细胞活化、增殖、凋亡及对逆境等多种生命活动的调控（Klee et al.，1998；Zhao et al.，1998；Batistic and Kudla，2004；Steinbach et al.，2006）。
本研究首次从草菇基因组中获得一个钙调磷酸酶催化亚基编码基因（Vv-CNA），经相关生物信息学分析，发现Vv-CNA开放阅读框长度1833 bp，含有4个内含子保留位点，编码610个氨基酸，CNA蛋白具备CNA最保守的结构域，但与其他物种尚存在一定差异。通过系统进化分析，发现Vv-CNA与密褐褶菌（G. trabeum）相似性最高，通过荧光定量PCR检测发现Vv-CNA基因在草菇蛋形期和伸长期菌柄呈上调表达，由此可推测该基因与草菇菌柄伸长有关。
张世伟（2014）研究发现，当破坏CNA时，细胞壁变薄，且细胞壁中多糖含量上升，几丁质含量明显下降，对细胞壁合成抑制剂刚果红的敏感性明显增强。由此表明，CN影响细胞壁的合成及其结构完整性。草菇等大型担子菌菌柄的伸长主要取决于细胞的伸长生长，而细胞的伸长主要由细胞壁的延伸所引起（Kües and Navarro-González，2015）。由此推测，Vv-CNA基因在蛋形期和伸长期菌柄中的上调表达可提高细胞壁的合成能力，从而促进菌柄细胞的伸长。由Ca2+参与的钙调信号转导途径是真核生物中影响生长过程的重要通路。CN调节途径是调节Ca2+浓度的关键途径，草菇中CN的发现有利于进一步探究其Ca2+信号转导途径的作用机制，但要获得CN在草菇钙离子信号通路中的具体作用机制还需进一步研究。
4 结论
Vv-CNA基因在草菇生长的蛋形期和伸长期表达量显著上调，推测该基因高表达有利于草菇菌柄的伸长。
参考文献：
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张世伟. 2014. 钙调磷酸酶催化亚基催化亚基调控球孢白僵菌生长发育、细胞壁结构完整性和毒力[D]. 重庆：西南大学.
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（責任编辑 罗 丽）