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摘要 分别使用电刺激法和直接刮擦法刺激大鲵，收集其所分泌的黏液。利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鲵体表黏液获得了大鲵低聚糖肽，研究大鲵低聚糖肽的酶解法条件、生物学特性、理化活性。 结果表明，大鲵皮肤黏液中存在抑菌成分，即低聚糖肽。
关键词 大鲵；皮肤黏液；抑菌成分；提取；低聚糖肽
中图分类号 TS254.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0226-01
Abstract Andrias davidianus were stimulated by electrical stimulation and direct scratches to collect the mucus. The enzymatic conditions，biological characterisics，physical and chemical activity of oligosaccharides from Andrias davidianus boby mucus were studied by enzymolysis of marine aspergillus acidic protease.The results showed that there was antibacterial component in the skin mucus of Andrias davidianus，that was oligosaccharide peptide.
Key words Andrias davidianus；skin mucus；antibacterial component；extraction；oligosaccharide peptide
中国大鲵（Andrias davidianus），属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国二级保护动物[1]。其肌肉、皮肤、器官、骨骼等都可以入药[2]，经常食用大鲵具有延缓衰老、聪明益智、提高造血和免疫功能的功效，有助于防治恶性贫血、心脑血管系统疾病和恶性肿瘤[3]。
人工养殖的大鲵皮中富含胶原蛋白，其含量约占大鲵皮中蛋白质总量的63.69%，大鲵皮胶原蛋白多肽还含有7种人体必需氨基酸，并具有良好的吸水性、保水性、湿润性等，可以直接用于食品中，有丰富的营养价值和药用保健价值[4]。
本文将大鲵体表黏液利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶（Aspergillus sp. Acid protease）进行酶解，获得大鲵低聚糖肽，进而研究了大鲵低聚糖肽的酶解法条件、生物学特性、理化活性[5-6]。这对大鲵体表黏液的深加工利用具有一定的理论和实际意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大鲵；海洋曲霉菌酸性蛋白酶；清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌、雄各1/2。
1.2 材料处理
分别使用电刺激法和直接刮擦法刺激大鲵，收集其所分泌的黏液，用无菌水清洗，冷冻，收集备用[7-9]。
1.3 最优酶解条件
通过正交试验，证实温度55 ℃、pH=2.0、E/S 0.03%、酶解时间3 h为海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鲵体表黏液的最优酶解条件。研究大鲵酶解物溶液共晶点、冻融过程以及冷冻浓缩过程，发现冷冻干燥操作前，于-15.6～-10.6 ℃对大鲵酶解物溶液进行预冻结，可使大鲵酶解物溶液浓度得到提高[5-7，10-12]。
1.4 飞行质谱检测
大鲵黏液酶解物经飞行质谱检测后被确认为大鲵低聚糖肽，且分子量低于3.5 kDa。大鲵低聚糖肽总糖含量、总蛋白含量分别为16.65%、82.61%。总糖中半乳糖醛酸、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、唾液酸占大鲵低聚糖肽的比例分别为2.55%、3.29%、0.85%、0.55%[13-14]。
经测定，大鲵低聚糖肽中氨基酸含量丰富，符合人体营养需求，除色氨酸未测出外，还含有较高的人体其他7种必需氨基酸，其中苏氨酸（Thr）、谷氨氨酸/酰胺（Glx）、丝氨酸（Ser）的含量分別达13.8%、12.6%、0.23%[8-11，15]，以苏氨酸（Thr）的含量最高。
1.5 不同剂量大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响
按体质量将小鼠分成3个剂量组，分别为0 g/kg体重（对照组）、0.01 g/kg体重（低剂量组）、0.1 g/kg体重（高剂量组）[5]，用大鲵低聚糖肽饲喂小鼠8 d后，研究发现，较之饲喂大鲵低聚糖肽0 g/kg体重的小鼠，饲喂大鲵低聚糖肽0.01、0.10 g/kg体重的小鼠的血清中免疫球蛋白含量、T淋巴细胞活性、巨噬细胞数与对照组相比均显著提高。
选雌性小鼠随机分成空白对照组、CCL4模型对照组和联苯双酯阳性对照组[210 mg/（kg·d）]，以及大鲵低聚糖肽高浓度剂量组[900 mg/（kg·d）]、低浓度剂量组[250 mg/（kg·d）]。各给药组给药灌胃2次/d，连续给药10 d后，测定大鲵低聚糖肽对小鼠肝细胞损伤的保护作用[4-5]。
将大鲵低聚糖肽按照2个浓度剂量，即150 mg/kg体重（低浓度组）和180 mg/kg体重（高浓度组）连续喂食小鼠，并每天按剂量0.3 mL/20 g体重灌胃，而对照组灌服相同体积的生理盐水，24 d后进行小鼠负重游泳试验[5-7]。结果显示，饲喂大鲵低聚糖肽180 mg/kg体重的小鼠的游泳竭力增加到80.5 min（P<0.01）。
2 结果与分析
2.1 大鲵低聚糖肽清除自由基的作用
大鲵低聚糖肽具有明显清除自由基的能力，清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基的能力随着浓度升高而逐渐增强。当浓度为2 mg/mL时，超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别达58.69%、91.25%、52.53%。 2.2 不同剂量大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响
光镜检查结果表明，CCl4模型组肝细胞明显肿胀变形，肝细胞索排列紊乱无序，并伴有炎症细胞侵润[5-6]。而大鲵低聚糖肽高剂量组中小鼠肝脏组织中血清谷草转氨酶（AST）活性、谷丙转氨酶（ALT）活性得到有效提升，而丙二醛（MDA）含量得到显著降低，促进了对超氧化物岐化酶（SOD）活性的提高。与模型组相比，大鲵低聚糖肽各剂量组的肝细胞排列有序、肝细胞索排列整齐，肝组织的损伤明显减轻[5-7]。
3 讨论
综上所述，本研究证明了大鲵皮肤黏液中存在抑菌成分，主要是低聚糖肽，该物质在不同领域有不同的作用，不同剂量的低聚糖肽对动物产生的影响也不同。并且介绍了提取低聚糖肽的方法——海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解法，以及对低聚糖肽利用价值的分析。由此可见，大鲵皮肤黏液中的低聚糖肽会使生物科学技术有很大的进展。
4 参考文献
[1] 侯进慧，朱必才，童玉玮，等.中国大鲵研究进展[J].四川动物，2004，23（3）：262-266.
[2] 李时珍.木草纲目[M].北京：中国书店影印出版社，1988.
[3] 张神虎.大鲵药用价值及人工养殖[J].广西农业生物科学，2001，20（4）：309-310.
[4] 杨玉凤.大鲵的药用价值及人工养殖[J].北京农业，2004（1）：28.
[5] 曲敏.大鲵黏液低聚糖肽的制备、性质和生物活性及应用研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2012.
[6] 陳德经，陈曦，方斌，等.大鲵不同部位的抑菌效果研究[J].安徽农业科学，2011（23）：14109-14110.
[7] 陈德经.大鲵黏液、皮肤及肉中氨基酸分析[J].食品科学，2010（18）：375-376.
[8] 侯进慧，朱必才，董玉玮.中国大鲵人工繁育及药用价值的研究概况[J].水产养殖，2004，25（6）：34-36.
[9] 黄智慧，马爱军，汪岷.鱼类体表黏液分泌功能与作用研究进展[J].海洋科学，2009，33（1）：90-94.
[10] 罗霞，潘厚军，巩华，等.鳜皮肤黏液IgM样蛋白的纯化[J].水产学报，2007，31（6）：726-730.
[11] 王长法，安利国，杨桂文，等.鱼类免疫球蛋白研究进展[J].中国水产科学，1999，6（2）：106-108.
[12] 高士贤，戴定远，范勤德.常见药用动物[M].上海：上海科技出版社，1984：140-141.
[13] 张丽萍，吴峰，梁刚.中国大鲵皮肤、肌肉与骨骼中6种微量元素测定[J].营养学报，2009，31（5）：519-520.
[14] 刘绍，孙麟，阳爱生，等.饲养中国大鲵氨基酸组成分析[J].氨基酸和生物资源，2007，29（4）：53-55.
关键词 大鲵；皮肤黏液；抑菌成分；提取；低聚糖肽
中图分类号 TS254.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0226-01
Abstract Andrias davidianus were stimulated by electrical stimulation and direct scratches to collect the mucus. The enzymatic conditions，biological characterisics，physical and chemical activity of oligosaccharides from Andrias davidianus boby mucus were studied by enzymolysis of marine aspergillus acidic protease.The results showed that there was antibacterial component in the skin mucus of Andrias davidianus，that was oligosaccharide peptide.
Key words Andrias davidianus；skin mucus；antibacterial component；extraction；oligosaccharide peptide
中国大鲵（Andrias davidianus），属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科，是我国二级保护动物[1]。其肌肉、皮肤、器官、骨骼等都可以入药[2]，经常食用大鲵具有延缓衰老、聪明益智、提高造血和免疫功能的功效，有助于防治恶性贫血、心脑血管系统疾病和恶性肿瘤[3]。
人工养殖的大鲵皮中富含胶原蛋白，其含量约占大鲵皮中蛋白质总量的63.69%，大鲵皮胶原蛋白多肽还含有7种人体必需氨基酸，并具有良好的吸水性、保水性、湿润性等，可以直接用于食品中，有丰富的营养价值和药用保健价值[4]。
本文将大鲵体表黏液利用海洋曲霉菌酸性蛋白酶（Aspergillus sp. Acid protease）进行酶解，获得大鲵低聚糖肽，进而研究了大鲵低聚糖肽的酶解法条件、生物学特性、理化活性[5-6]。这对大鲵体表黏液的深加工利用具有一定的理论和实际意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大鲵；海洋曲霉菌酸性蛋白酶；清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌、雄各1/2。
1.2 材料处理
分别使用电刺激法和直接刮擦法刺激大鲵，收集其所分泌的黏液，用无菌水清洗，冷冻，收集备用[7-9]。
1.3 最优酶解条件
通过正交试验，证实温度55 ℃、pH=2.0、E/S 0.03%、酶解时间3 h为海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解大鲵体表黏液的最优酶解条件。研究大鲵酶解物溶液共晶点、冻融过程以及冷冻浓缩过程，发现冷冻干燥操作前，于-15.6～-10.6 ℃对大鲵酶解物溶液进行预冻结，可使大鲵酶解物溶液浓度得到提高[5-7，10-12]。
1.4 飞行质谱检测
大鲵黏液酶解物经飞行质谱检测后被确认为大鲵低聚糖肽，且分子量低于3.5 kDa。大鲵低聚糖肽总糖含量、总蛋白含量分别为16.65%、82.61%。总糖中半乳糖醛酸、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、唾液酸占大鲵低聚糖肽的比例分别为2.55%、3.29%、0.85%、0.55%[13-14]。
经测定，大鲵低聚糖肽中氨基酸含量丰富，符合人体营养需求，除色氨酸未测出外，还含有较高的人体其他7种必需氨基酸，其中苏氨酸（Thr）、谷氨氨酸/酰胺（Glx）、丝氨酸（Ser）的含量分別达13.8%、12.6%、0.23%[8-11，15]，以苏氨酸（Thr）的含量最高。
1.5 不同剂量大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响
按体质量将小鼠分成3个剂量组，分别为0 g/kg体重（对照组）、0.01 g/kg体重（低剂量组）、0.1 g/kg体重（高剂量组）[5]，用大鲵低聚糖肽饲喂小鼠8 d后，研究发现，较之饲喂大鲵低聚糖肽0 g/kg体重的小鼠，饲喂大鲵低聚糖肽0.01、0.10 g/kg体重的小鼠的血清中免疫球蛋白含量、T淋巴细胞活性、巨噬细胞数与对照组相比均显著提高。
选雌性小鼠随机分成空白对照组、CCL4模型对照组和联苯双酯阳性对照组[210 mg/（kg·d）]，以及大鲵低聚糖肽高浓度剂量组[900 mg/（kg·d）]、低浓度剂量组[250 mg/（kg·d）]。各给药组给药灌胃2次/d，连续给药10 d后，测定大鲵低聚糖肽对小鼠肝细胞损伤的保护作用[4-5]。
将大鲵低聚糖肽按照2个浓度剂量，即150 mg/kg体重（低浓度组）和180 mg/kg体重（高浓度组）连续喂食小鼠，并每天按剂量0.3 mL/20 g体重灌胃，而对照组灌服相同体积的生理盐水，24 d后进行小鼠负重游泳试验[5-7]。结果显示，饲喂大鲵低聚糖肽180 mg/kg体重的小鼠的游泳竭力增加到80.5 min（P<0.01）。
2 结果与分析
2.1 大鲵低聚糖肽清除自由基的作用
大鲵低聚糖肽具有明显清除自由基的能力，清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基的能力随着浓度升高而逐渐增强。当浓度为2 mg/mL时，超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别达58.69%、91.25%、52.53%。 2.2 不同剂量大鲵低聚糖肽对小鼠免疫功能的影响
光镜检查结果表明，CCl4模型组肝细胞明显肿胀变形，肝细胞索排列紊乱无序，并伴有炎症细胞侵润[5-6]。而大鲵低聚糖肽高剂量组中小鼠肝脏组织中血清谷草转氨酶（AST）活性、谷丙转氨酶（ALT）活性得到有效提升，而丙二醛（MDA）含量得到显著降低，促进了对超氧化物岐化酶（SOD）活性的提高。与模型组相比，大鲵低聚糖肽各剂量组的肝细胞排列有序、肝细胞索排列整齐，肝组织的损伤明显减轻[5-7]。
3 讨论
综上所述，本研究证明了大鲵皮肤黏液中存在抑菌成分，主要是低聚糖肽，该物质在不同领域有不同的作用，不同剂量的低聚糖肽对动物产生的影响也不同。并且介绍了提取低聚糖肽的方法——海洋曲霉菌酸性蛋白酶酶解法，以及对低聚糖肽利用价值的分析。由此可见，大鲵皮肤黏液中的低聚糖肽会使生物科学技术有很大的进展。
4 参考文献
[1] 侯进慧，朱必才，童玉玮，等.中国大鲵研究进展[J].四川动物，2004，23（3）：262-266.
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[7] 陈德经.大鲵黏液、皮肤及肉中氨基酸分析[J].食品科学，2010（18）：375-376.
[8] 侯进慧，朱必才，董玉玮.中国大鲵人工繁育及药用价值的研究概况[J].水产养殖，2004，25（6）：34-36.
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[11] 王长法，安利国，杨桂文，等.鱼类免疫球蛋白研究进展[J].中国水产科学，1999，6（2）：106-108.
[12] 高士贤，戴定远，范勤德.常见药用动物[M].上海：上海科技出版社，1984：140-141.
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[14] 刘绍，孙麟，阳爱生，等.饲养中国大鲵氨基酸组成分析[J].氨基酸和生物资源，2007，29（4）：53-55.