【摘 要】
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目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌.方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA
【机 构】
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南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系
【基金项目】
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广东省社会发展领域科技计划项目;广州市科技亚运专项
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目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌.方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性.结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系.灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88％.结论 本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法.
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