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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.028
摘要：采用目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术，研究红豆杉18份种质的遗传多样性及种质间的遗传关系，为红豆杉资源的保护、利用以及遗传育种提供依据。以18份红豆杉种质资源为材料，从80条引物中筛选出19条重复性好、条带清晰的引物进行PCR扩增，利用NTSYS-pc2.10e软件对其扩增位点多态性进行分析。结果表明：19条引物共扩增出134条带，其中97条具有多态性，多态性带比率为72.39%。18个红豆杉种质间遗传相似系数在031～0.89之间，说明SCoT标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。利用UPGMA进行系统的聚类分析显示，在相似系数0.53处可将18份红豆杉资源分成两大类；主坐标分析结果与聚类分析结果相一致。红豆杉资源具有较丰富的遗传多样性，SCoT分子标记技术可有效地从分子水平揭示红豆杉种质资源的遗传背景和亲缘关系。
关键词：红豆杉；目标起始密码子多态性（SCoT）；遗传多样性；聚类分析；亲缘关系
中图分类号： S791.490.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0116-04
收稿日期：2015-09-25
基金项目：河南省科学攻关计划 （编号：122102310652）；河南省环境科学重点学科建设项目（编号：Pxy-zdxk-2013003）。
作者简介：陈明辉（1974—），男，河南平顶山人，博士，讲师，主要从事植物生理生化及分子生物学研究。E-mail：cmh_abc@126.com。
通信作者：杨风玲，博士，教授，主要从事植物化学研究。E-mail：yangfl0001@163.com。红豆杉[Taxus chinensis （Pilger） Rehd.]是第四世纪孑遗植物，已在地球上生活250万年，是我国Ⅰ级重点保护野生植物，被称为活化石[1-2]。1971年，美国科学家Wani等首次从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）树皮中提取获得抗癌药物紫杉醇（Taxol）[3]，此后红豆杉的药用价值及其开发在我国广泛开展。红豆杉生长缓慢，极少成林，资源极其贫乏，而且紫杉醇含量仅为0.01%，由于红豆杉资源遭到严重破坏而数量急剧下降，目前天然红豆杉已处于严重濒危状态；所以，关于红豆杉的繁殖、保护与利用已成为当前多个学科的研究热点[4-11]。
目前红豆杉分子标记研究取得了一定的成果。张雪梅等通过对南方红豆杉18个居群进行了RFLP分析，发现南方红豆杉现在的遗传结构可能源于居群的片段化效应[12]；Miao等利用SSR技术对14个居群的南方红豆杉生境断裂谱系和遗传效应进行了研究，结果发现生境断裂导致了云南红豆杉近亲繁殖和种群分化[13]；吴琼等利用基于红豆杉转录组进行高通量测序进而发掘基因表达谱多态性标记[14]。但这些分子标记方法成本较高，操作复杂。目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子标记技术是Collard等[15]开发的一种基于SPAR（单引物扩增反应）的目的基因分子标记新技术。SCoT依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增[16]。SCoT标记结合ISSR标记和RAPD标记的优点，操作简单、成本低廉、多态性丰富，能有效地产生与性状联系的标记，是一种能跟踪性状的新的分子标记，有利于分子辅助育种[17-18]。该分子标记技术已被成功应用于花生[19]、龙眼[20]、芒果[21-22]等植物。本研究利用SCoT分子标记技术，从DNA水平研究了红豆杉18份种质的遗传多样性及种质间的遗传关系，以期对其亲缘关系有更全面了解，为资源的保护、利用以及遗传育种提供依据。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为2013—2014年采自不同地区的18份红豆杉种质资源（表1），取其幼嫩叶片迅速置于液氮中速冻，带回实验室后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。试验用的80对SCoT分子标记引物序列分别参照Collard等[15]和Luo等[22]设计的引物合成，所有引物由上海生工生物工程公司合成。dNTPs、DL2000 marker和TaqDNA聚合酶以及其他试剂均购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2方法
1.2.1DNA提取与检测采用改良的CTAB法[23]提取DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，同时用岛津BioSpec-nano型超微量分光光度计分析仪检测DNA样品质量和浓度。模板DNA稀释至50 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。
1.2.2SCoT-PCR扩增PCR扩增在ABI Veriti 梯度 PCR扩增仪上进行。采用20 μL的反应体系，其中含50 ng/μL模板DNA 1.0 μL、10×buffer（含Mg2 ）2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL、10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，加ddH2O至20 μL。擴增程序为94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，复性退火（温度随引物而定）1 min，72 ℃ 延伸5 min，共36个循环；72 ℃延伸8 min。扩增反应结束后，取5 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，染色后在紫外凝胶成像系统上拍照保存。
1.3数据统计与分析
SCoT产物按条带的有无分别赋值，在相同迁移位置有带记为1，无带记为0，建立SCoT标记的0、1矩阵。把得到的0、1矩阵输入NTSYS-pc2.10e计算遗传相似性系数，并进行UPGMA聚类分析，构建树状图，分析样品间亲缘关系。利用NTSYS-pc2.10e软件将遗传相似系数进行Dcenter数据转化，求其特征量和特征向量，得到主坐标分析图，进行主坐标分析。 2结果与分析
2.1SCoT扩增片段多态性分析
从80条引物中筛选出重复性好、扩增条带清晰、多态性强的SCoT引物19条。利用这19条引物对18份红豆杉种质资源进行扩增，每条引物可扩增出4～14条带，平均多态性条带为5～10条。扩增出的DNA带的大小介于100～1 800 bp，其中代表性扩增图谱见图1。19条引物共扩增出134个DNA位点，其中97个位点具有多态性，多态性比例为72.4%，说明供试的样品遗传多样性比较丰富，多态性最高的是引物SCoT8和SCoT31，均达到100%，多态性最低的是引物SCoT17，为4286%（表2）。
2.2相似系数分析
用NTSYS-pc2.10e软件计算红豆杉种质间的Jaccard遗传相似系数（表3）。表3结果表明：18个不同地区红豆杉种质间的遗传相似系数范围在0.31～0.89之间。其中河南济源黑龙沟的4号与河南济源西坪村的5号相似系数为089，河南卢氏县柴家沟的6号与河南卢氏县毛河村的10号、甘肃徽县北禅寺-2的14号的相似系数都为0.89，表明4号与5号、6号与10号、6号与14号的亲缘关系较近。河南获嘉县的3号与重庆猫儿山的18号相似系数为最小，为031，说明3号与18号亲缘关系最远。
2.3聚类分析
根据遗传相似系数，采用UPGMA系统聚类法构建了红豆杉试材间的遗传关系聚类图（图2）。从聚类图（图2）来看，在相似系数0.53为阈值时，可将所有供试材料分为Ⅰ和Ⅱ两大类。Ⅰ类包括4份材料，分别为神龙湾的1号、双底村的2号、获嘉县的3号和平顶山-2的8号；Ⅱ类包括14份材料。在阈值约为0.61时，Ⅱ类又可分成Ⅱa和Ⅱb两个亚类，其中Ⅱa亚类包括黑龙沟的4号、西坪村的5号、平顶山-1的7号、石鼓村的9号、宣恩县的12号、贵阳的17号等6份材料；Ⅱb亚类包括柴家沟的6号、毛河村的10号、尧山的11号、北禅寺-1的13号、北禅寺-2的14号、天水的15号、两当县的16号、猫儿山的18号等8份材料。2.4主坐标分析
根据18份红豆杉材料SCoT标记产生的数据进行主坐标分析，绘制三维散点图（图3）。从主坐标图（图3）可看出，18份红豆杉材料被分为3组，第1组为1号、2号、3号和8号，位于主坐标图的右方；第2组为4号、5号、7号、9号、12号和17号，位于主坐标图的左方；第3组为6号、10号、11号、13号、14号、15号、16号和18号，分布在主坐标图的中间偏下方。其中第2、3组距离相对较近，它们与第1组距离较远，但第3组的15号与第1组距离较近。主坐标分析结果显示，第1组红豆杉与第2、3组红豆杉在分子水平上表现出了较大的遗传差异，主坐标分析可以从不同方向、不同层面更加直观地显示各材料间的关系。
3结论与讨论
SCoT标记是一种基于翻译起始位点的目标分子标记新技术，SCoT单引物在PCR反应中充当上下游引物的角色，从而使得引物结合位点之间的片段得以有效扩增，可获得丰富的遗传信息[24-25]，所以其在红豆杉的遗传多样性和亲缘关系分类上具有一定的可靠性。本研究将SCoT标记技术应用于红豆杉材料的DNA多态性鉴定，在红豆杉各材料内均检测到较丰富的多态性，选用的19条SCoT引物具有很高的多态性，平均多态率达到73.19%。SCoT标记与功能基因相关，能在红豆杉各材料之间检测出较丰富的遗传多态性，这与红豆杉各资源间具有较丰富的多态性相一致，是进一步开发特定功能基因标记和建立分子标记辅助育种技术体系的基础。
从本试验聚类结果可以看出，在Ⅰ组的4个红豆杉材料中，8号平顶山-2红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为东北红豆杉，这4份红豆杉材料聚为一个类群，说明它们亲缘关系较近，同属于东北红豆杉体系；在第Ⅱ类的Ⅱa亚类中，有6份红豆杉材料聚为一个类群，其中7号平顶山-1和9号石鼓村红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为南方红豆杉，说明这个类群中的6份红豆杉和南方红豆杉具有密切的渊源，构成独特的遗传资源。在第Ⅱ类的Ⅱb亚类中，有8份红豆杉材料聚为一个类群，其中6号柴家沟红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为中国红豆杉，说明这个类群中的8份红豆杉和秦岭一带的中国红豆杉遗传关系较近。
由以上分析可知，本试验的SCoT分子标记数据在一定程度上反映了不同材料红豆杉地理分布情况，说明地理因素对红豆杉的亲缘关系有很大影响；但是，有些地理距离远而遗传距离却比较相近，这可能与其具有相似的环境条件和常年的引种有关。
参考文献：
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摘要：采用目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术，研究红豆杉18份种质的遗传多样性及种质间的遗传关系，为红豆杉资源的保护、利用以及遗传育种提供依据。以18份红豆杉种质资源为材料，从80条引物中筛选出19条重复性好、条带清晰的引物进行PCR扩增，利用NTSYS-pc2.10e软件对其扩增位点多态性进行分析。结果表明：19条引物共扩增出134条带，其中97条具有多态性，多态性带比率为72.39%。18个红豆杉种质间遗传相似系数在031～0.89之间，说明SCoT标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。利用UPGMA进行系统的聚类分析显示，在相似系数0.53处可将18份红豆杉资源分成两大类；主坐标分析结果与聚类分析结果相一致。红豆杉资源具有较丰富的遗传多样性，SCoT分子标记技术可有效地从分子水平揭示红豆杉种质资源的遗传背景和亲缘关系。
关键词：红豆杉；目标起始密码子多态性（SCoT）；遗传多样性；聚类分析；亲缘关系
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目前红豆杉分子标记研究取得了一定的成果。张雪梅等通过对南方红豆杉18个居群进行了RFLP分析，发现南方红豆杉现在的遗传结构可能源于居群的片段化效应[12]；Miao等利用SSR技术对14个居群的南方红豆杉生境断裂谱系和遗传效应进行了研究，结果发现生境断裂导致了云南红豆杉近亲繁殖和种群分化[13]；吴琼等利用基于红豆杉转录组进行高通量测序进而发掘基因表达谱多态性标记[14]。但这些分子标记方法成本较高，操作复杂。目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子标记技术是Collard等[15]开发的一种基于SPAR（单引物扩增反应）的目的基因分子标记新技术。SCoT依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增[16]。SCoT标记结合ISSR标记和RAPD标记的优点，操作简单、成本低廉、多态性丰富，能有效地产生与性状联系的标记，是一种能跟踪性状的新的分子标记，有利于分子辅助育种[17-18]。该分子标记技术已被成功应用于花生[19]、龙眼[20]、芒果[21-22]等植物。本研究利用SCoT分子标记技术，从DNA水平研究了红豆杉18份种质的遗传多样性及种质间的遗传关系，以期对其亲缘关系有更全面了解，为资源的保护、利用以及遗传育种提供依据。
1材料与方法
1.1材料
试验材料为2013—2014年采自不同地区的18份红豆杉种质资源（表1），取其幼嫩叶片迅速置于液氮中速冻，带回实验室后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。试验用的80对SCoT分子标记引物序列分别参照Collard等[15]和Luo等[22]设计的引物合成，所有引物由上海生工生物工程公司合成。dNTPs、DL2000 marker和TaqDNA聚合酶以及其他试剂均购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2方法
1.2.1DNA提取与检测采用改良的CTAB法[23]提取DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，同时用岛津BioSpec-nano型超微量分光光度计分析仪检测DNA样品质量和浓度。模板DNA稀释至50 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。
1.2.2SCoT-PCR扩增PCR扩增在ABI Veriti 梯度 PCR扩增仪上进行。采用20 μL的反应体系，其中含50 ng/μL模板DNA 1.0 μL、10×buffer（含Mg2 ）2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL、10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，加ddH2O至20 μL。擴增程序为94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，复性退火（温度随引物而定）1 min，72 ℃ 延伸5 min，共36个循环；72 ℃延伸8 min。扩增反应结束后，取5 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，染色后在紫外凝胶成像系统上拍照保存。
1.3数据统计与分析
SCoT产物按条带的有无分别赋值，在相同迁移位置有带记为1，无带记为0，建立SCoT标记的0、1矩阵。把得到的0、1矩阵输入NTSYS-pc2.10e计算遗传相似性系数，并进行UPGMA聚类分析，构建树状图，分析样品间亲缘关系。利用NTSYS-pc2.10e软件将遗传相似系数进行Dcenter数据转化，求其特征量和特征向量，得到主坐标分析图，进行主坐标分析。 2结果与分析
2.1SCoT扩增片段多态性分析
从80条引物中筛选出重复性好、扩增条带清晰、多态性强的SCoT引物19条。利用这19条引物对18份红豆杉种质资源进行扩增，每条引物可扩增出4～14条带，平均多态性条带为5～10条。扩增出的DNA带的大小介于100～1 800 bp，其中代表性扩增图谱见图1。19条引物共扩增出134个DNA位点，其中97个位点具有多态性，多态性比例为72.4%，说明供试的样品遗传多样性比较丰富，多态性最高的是引物SCoT8和SCoT31，均达到100%，多态性最低的是引物SCoT17，为4286%（表2）。
2.2相似系数分析
用NTSYS-pc2.10e软件计算红豆杉种质间的Jaccard遗传相似系数（表3）。表3结果表明：18个不同地区红豆杉种质间的遗传相似系数范围在0.31～0.89之间。其中河南济源黑龙沟的4号与河南济源西坪村的5号相似系数为089，河南卢氏县柴家沟的6号与河南卢氏县毛河村的10号、甘肃徽县北禅寺-2的14号的相似系数都为0.89，表明4号与5号、6号与10号、6号与14号的亲缘关系较近。河南获嘉县的3号与重庆猫儿山的18号相似系数为最小，为031，说明3号与18号亲缘关系最远。
2.3聚类分析
根据遗传相似系数，采用UPGMA系统聚类法构建了红豆杉试材间的遗传关系聚类图（图2）。从聚类图（图2）来看，在相似系数0.53为阈值时，可将所有供试材料分为Ⅰ和Ⅱ两大类。Ⅰ类包括4份材料，分别为神龙湾的1号、双底村的2号、获嘉县的3号和平顶山-2的8号；Ⅱ类包括14份材料。在阈值约为0.61时，Ⅱ类又可分成Ⅱa和Ⅱb两个亚类，其中Ⅱa亚类包括黑龙沟的4号、西坪村的5号、平顶山-1的7号、石鼓村的9号、宣恩县的12号、贵阳的17号等6份材料；Ⅱb亚类包括柴家沟的6号、毛河村的10号、尧山的11号、北禅寺-1的13号、北禅寺-2的14号、天水的15号、两当县的16号、猫儿山的18号等8份材料。2.4主坐标分析
根据18份红豆杉材料SCoT标记产生的数据进行主坐标分析，绘制三维散点图（图3）。从主坐标图（图3）可看出，18份红豆杉材料被分为3组，第1组为1号、2号、3号和8号，位于主坐标图的右方；第2组为4号、5号、7号、9号、12号和17号，位于主坐标图的左方；第3组为6号、10号、11号、13号、14号、15号、16号和18号，分布在主坐标图的中间偏下方。其中第2、3组距离相对较近，它们与第1组距离较远，但第3组的15号与第1组距离较近。主坐标分析结果显示，第1组红豆杉与第2、3组红豆杉在分子水平上表现出了较大的遗传差异，主坐标分析可以从不同方向、不同层面更加直观地显示各材料间的关系。
3结论与讨论
SCoT标记是一种基于翻译起始位点的目标分子标记新技术，SCoT单引物在PCR反应中充当上下游引物的角色，从而使得引物结合位点之间的片段得以有效扩增，可获得丰富的遗传信息[24-25]，所以其在红豆杉的遗传多样性和亲缘关系分类上具有一定的可靠性。本研究将SCoT标记技术应用于红豆杉材料的DNA多态性鉴定，在红豆杉各材料内均检测到较丰富的多态性，选用的19条SCoT引物具有很高的多态性，平均多态率达到73.19%。SCoT标记与功能基因相关，能在红豆杉各材料之间检测出较丰富的遗传多态性，这与红豆杉各资源间具有较丰富的多态性相一致，是进一步开发特定功能基因标记和建立分子标记辅助育种技术体系的基础。
从本试验聚类结果可以看出，在Ⅰ组的4个红豆杉材料中，8号平顶山-2红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为东北红豆杉，这4份红豆杉材料聚为一个类群，说明它们亲缘关系较近，同属于东北红豆杉体系；在第Ⅱ类的Ⅱa亚类中，有6份红豆杉材料聚为一个类群，其中7号平顶山-1和9号石鼓村红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为南方红豆杉，说明这个类群中的6份红豆杉和南方红豆杉具有密切的渊源，构成独特的遗传资源。在第Ⅱ类的Ⅱb亚类中，有8份红豆杉材料聚为一个类群，其中6号柴家沟红豆杉经中国科学院植物研究所鉴定为中国红豆杉，说明这个类群中的8份红豆杉和秦岭一带的中国红豆杉遗传关系较近。
由以上分析可知，本试验的SCoT分子标记数据在一定程度上反映了不同材料红豆杉地理分布情况，说明地理因素对红豆杉的亲缘关系有很大影响；但是，有些地理距离远而遗传距离却比较相近，这可能与其具有相似的环境条件和常年的引种有关。
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